閆松松 苗 亮 李明云 范慧慧 胡 謀 陳 炯 史雨紅

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211)

香魚(Plecoglossus altivelis)屬胡瓜魚目(Osmeriformes)、香魚科(Plecoglossidae)、香魚屬(Plecoglossus),是一種小型名貴經(jīng)濟(jì)魚類,有“淡水魚之王”的美稱。目前中國大陸的野生香魚資源已瀕臨枯竭,自 20世紀(jì)80年代末、90年代初實(shí)現(xiàn)全人工育苗和養(yǎng)殖以來,香魚養(yǎng)殖業(yè)獲得了很大的發(fā)展(李明云等,1999)。國內(nèi)研究人員已對香魚的繁殖生物學(xué)、育苗與養(yǎng)殖技術(shù)以及病害與免疫等方面進(jìn)行了較多研究(李明云等,2000,2012;Shimizuet al,2008;Liet al,2011;范慧慧等,2012),但在群體遺傳多樣性方面僅有少數(shù)對野生群體的研究報(bào)道:同工酶分析顯示寧波鳧溪野生香魚的遺傳多樣性較豐富(黃福勇等,2004);線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)的多態(tài)性分析則顯示浙江瑞安、福建寧德和福建東張水庫 3個香魚野生群體的遺傳多樣性水平都不高,特別是東張水庫群體的遺傳多樣性非常貧乏(李娜等,2008;魯延付等,2009)。而香魚養(yǎng)殖群體受有效繁殖群體較小、近親交配等影響,也面臨種質(zhì)退化的危險(xiǎn)。因此有必要了解養(yǎng)殖香魚群體的遺傳多樣性,以便采取措施保護(hù)香魚資源。另外,香魚雌魚比雄魚的經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高,如果能夠?qū)崿F(xiàn)全雌養(yǎng)殖,可大幅提高經(jīng)濟(jì)效益。雖然已對香魚進(jìn)行了雌核發(fā)育誘導(dǎo)研究(Taniguchiet al,1988,1990),但目前尚沒有可以鑒定香魚遺傳性別的方法。

AFLP(Amplified fragment length polymorphism)即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性,是由Zabeau和Vos(1993)發(fā)明的一種檢測 DNA多態(tài)性的方法,具有無需知道DNA序列信息、擴(kuò)增條帶多、靈敏度高、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、性別特異性標(biāo)記篩選、種質(zhì)資源鑒定等諸多領(lǐng)域(Nakamuraet al,2001;王偉繼等,2005;張?zhí)系?2013)。特別是使用 AFLP技術(shù)已經(jīng)在三刺魚(Griffithset al,2000)、半滑舌鰨(Chenet al,2007)、羅非魚(楊東等,2007)、鯉魚(Chenet al,2010)等多種魚類中篩選到了性別特異性分子標(biāo)記。

本文用 AFLP技術(shù)分析香魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性,同時(shí)篩選與性別相關(guān)的分子標(biāo)記,以期為香魚養(yǎng)殖群體的遺傳改良和性別調(diào)控研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚均為采自浙江省寧?？h鳧溪香魚養(yǎng)殖場的性成熟香魚(體重70—120g),共2批,其中2010年9月隨機(jī)采集雌性香魚15尾,雄性香魚15尾,共30尾用于AFLP分析,2011年9月隨機(jī)采集雌性香魚5尾,雄性香魚5尾,共10尾用于性別特異性標(biāo)記驗(yàn)證。所取香魚均解剖鑒定生理性別后取背部肌肉,液氮速凍后–80°C保存,使用常規(guī)酚氯仿法提取香魚肌肉基因組DNA。

1.2 AFLP分析

AFLP實(shí)驗(yàn)方法按照試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)說明書進(jìn)行。基因組DNA經(jīng)EcoR I/MseI雙酶切后與接頭相連接,先進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,用15對引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增(引物組合見表1,其中E代表GACTGCGTACCAATTC,M代表GATGAGTC CTGAGTAA)。選擴(kuò)產(chǎn)物進(jìn)行8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,硝酸銀染色顯示條帶,凝膠成像后用 Quantity One 4.62(Bio-Rad公司)統(tǒng)計(jì)、分析條帶。用POPGEN 1.31計(jì)算多態(tài)性比例P、基因多樣性指數(shù)H、Shannon氏指數(shù)I等遺傳多樣性參數(shù)(劉翠等,2011)。根據(jù)個體之間的遺傳相似系數(shù),采用 NTSYS軟件以UPGMA法對30個個體做聚類分析,繪制親緣關(guān)系樹。

1.3 性別特異性條帶篩選

對經(jīng)解剖確定性別的香魚,進(jìn)行雌、雄兩性間的AFLP擴(kuò)增條帶對比,性別特異性條帶用聚丙烯酰胺膠回收試劑盒(OMEGA公司)回收后克隆至pMD19-T載體(Takara公司)中進(jìn)行測序。用DNAMAN 4.0進(jìn)行序列比對,并在GenBank中進(jìn)行BLAST檢測。

1.4 性別特異性引物設(shè)計(jì)與PCR驗(yàn)證

根據(jù)測序結(jié)果,設(shè)計(jì) 1對 PCR 引物(上游 5′CAATTCATGTCCCATCATCAC 3’;下游 5’ GAGTAA CTGCATTTTTCTGCC 3’),以香魚基因組DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,程序?yàn)?94°C預(yù)變性 1min;94°C變性30s,56°C退火30s,72°C延伸1min,循環(huán)30次;72°C延伸5min;6°C保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性

用 15對選擴(kuò)引物組合對 30尾養(yǎng)殖香魚進(jìn)行AFLP擴(kuò)增,條帶分析結(jié)果見表1。各對引物組合的擴(kuò)增條帶數(shù)為 41—72個,其中多態(tài)性條帶數(shù)為 15—46個,各位點(diǎn)的多態(tài)率為 22.39%—70.77%;共擴(kuò)增到889個位點(diǎn)(平均每對引物59.27個),其中多態(tài)性位點(diǎn)共 380個(平均每對引物 25.33個),占總位點(diǎn)數(shù)的42.74%;被測群體的Nei氏遺傳多樣性指數(shù)為0.0727—0.2724(平均 0.1454),Shannon氏指數(shù)為 0.1111—0.3971(平均 0.2174)。群體內(nèi)個體間的遺傳相似度最高為 0.9393,最低為 0.7975,平均遺傳相似度為0.8575;遺傳距離在 0.0607—0.2025之間(平均0.1425)。

表1 香魚養(yǎng)殖群體的AFLP遺傳多樣性Tab.1 AFLP genetic diversity of cultured P.altivelis

2.2 性別特異性標(biāo)記的篩選與驗(yàn)證

由圖1可見,在15對選擴(kuò)引物組合中,僅引物組合 E-ATG/M-CTG擴(kuò)增到一條雄性特異性條帶。切膠回收后測序顯示該片段含有 139個堿基,序列見圖2,15尾雄性個體中該片段的堿基序列一致。經(jīng)BLAST檢索,在GenBank中未找到任何與該片段同源的序列。

圖1 香魚雄性特異性AFLP條帶(引物組合:E-ATG/M-CTG)Fig.1 The male-special AFLP band of P.altivelis(primer pairs:E-ATG/M-CTG)

圖2 香魚雄性特異性AFLP條帶的堿基序列(小寫字母示引物序列)Fig.2 DNA sequence of male-special AFLP marker in P.altivelis(lowercase letters show the primers)

根據(jù)雄性特異性條帶的測序結(jié)果設(shè)計(jì) 1對 PCR引物,對經(jīng)解剖檢查性腺確定性別10尾香魚(雌、雄各5尾)的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,電泳結(jié)果顯示5尾雄性個體中均能擴(kuò)增到一條特異的、大小為120bp的DNA條帶,而5尾雌性個體中均無此目標(biāo)條帶(圖3)。表明該 DNA標(biāo)記是雄性特異性的,并可通過普通PCR擴(kuò)增檢測香魚個體的遺傳性別鑒定。

圖3 香魚雄性特異性標(biāo)記的PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR identification of the male-special marker in P.altivelis

3 討論

3.1 遺傳多樣性水平

生物群體的遺傳多樣性是評價(jià)生物資源狀況的一個重要依據(jù),它是物種適應(yīng)多變的環(huán)境、維持長期生存和進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)。自20世紀(jì)80、90年代以來,我國香魚自然資源銳減,多處地方的野生香魚瀕臨滅絕,有的甚至已經(jīng)絕跡(李明云等,1999)。香魚已被列入中國瀕危動物紅皮書,浙江、福建、河北、遼寧等地將其列為省級重點(diǎn)保護(hù)動物,并進(jìn)行了人工養(yǎng)殖、增殖放流和野生資源調(diào)查與保護(hù)等方面的工作。研究香魚的群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性對于保護(hù)香魚資源、避免種質(zhì)退化、指導(dǎo)增殖放流等都有重要意義。

黃福勇等(2004)對寧波鳧溪野生香魚的同工酶生化遺傳分析結(jié)果顯示該群體的遺傳多樣性較豐富。而對浙江瑞安、福建寧德和福建東張水庫3個香魚野生地理群體的線粒體 Cytb基因、D-loop序列和ND4-tRNASer基因的遺傳分析顯示這 3個群體的遺傳多樣性水平均較低,特別是東張水庫群體的遺傳多樣性非常貧乏(李娜等,2008;魯延付等,2009)。香魚不同群體間的遺傳多樣性相差較大,這可能與各個群體間的基因交流較少有關(guān)。香魚為一年生洄游型魚類,成魚秋季在河口處產(chǎn)卵后死亡,仔魚移至海中越冬后于次年春季返回淡水生活,仔稚魚受游動能力限制,活動范圍和遷移距離有限,限制了不同地理群體間的基因交流,特別是有些群體還因洄游通道被阻斷而成為終生在封閉淡水水體中生活的陸封型香魚群體(如福建東張水庫)。另外,有些瀕危群體受有限繁殖群體數(shù)量的限制,其遺傳多樣性水平往往較低,如Seki等(1999)的AFLP分析結(jié)果顯示日本奄美大島川內(nèi)河中瀕臨滅絕香魚群體的多態(tài)位點(diǎn)比例僅有13.5%,而其它2個野生香魚群體的多態(tài)位點(diǎn)比例則分別為55.0%和52.1%。

本研究中所用浙江寧海香魚養(yǎng)殖群體已經(jīng)過近10年的連續(xù)人工繁育,其 AFLP多態(tài)性位點(diǎn)比例(42.74%)雖低于Seki等(1999)研究的日本野生香魚群體,但與大黃魚(黎中寶等,2009)、半滑舌鰨(韓志強(qiáng)等,2007)、西伯利亞鱘(劉翠等,2011)、牙鲆(張全啟等,2004)、鯉魚(鐘立強(qiáng)等,2010)、卵形鯧鲹(彭敏等,2011)等養(yǎng)殖魚類相比,其遺傳多樣性仍較豐富,處于中等偏上水平。這一方面是因?yàn)槠湓加H本群體——野生鳧溪香魚遺傳多樣性水平較高,另一方面也可能與每年的香魚人工育苗中均使用較大數(shù)量親本有關(guān)。但現(xiàn)在鳧溪香魚野生群體已基本絕跡,因此在人工育苗和養(yǎng)殖中一方面要避免外來群體的混雜,另一方面要采用合理的育種方法避免種質(zhì)退化和遺傳多樣性下降。

3.2 香魚性別特異性標(biāo)記

魚類遺傳性別的鑒定在水產(chǎn)養(yǎng)殖和遺傳育種領(lǐng)域有著重要的理論研究和應(yīng)用價(jià)值,但魚類的性別決定機(jī)制特別復(fù)雜,絕大多數(shù)魚類并未進(jìn)化出性染色體或性染色體沒有異型分化,并且常染色體基因和溫度、pH、光周期等環(huán)境因素也會影響魚類的性別(Sandraet al,2010)。尋找性別特異性的分子標(biāo)記是目前鑒定魚類遺傳性別的常用和有效方法之一。RAPD、SSR、AFLP、SSH的技術(shù)方法都已被用于篩選魚類性別特異性標(biāo)記(Kovacset al,2001;Chenet al,2010;Fujiet al,2010)。AFLP具有基因組覆蓋率高、擴(kuò)增位點(diǎn)豐富、條帶多態(tài)性高及可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),已在三刺魚(Griffithset al,2000)、海鱸(Nakamuraet al,2001)、北極鮭魚(Rachaelet al,2003)、半滑舌鰨(Chenet al,2007)、鯉魚(Chenet al,2010)、黃顙魚(魯翠云等,2007)、羅非魚(楊東等,2007)等多種魚類中找到了性別特異性標(biāo)記或篩選到了性別差異條帶。

香魚屬于胡瓜魚目、香魚科,目前尚未有胡瓜魚目魚類性別決定類型和機(jī)制等方面的研究報(bào)道。染色體核型分析顯示香魚沒有異型分化的性染色體(張春丹等,2005)。Watanabe等(2004)在對日本香魚的AFLP檢測中發(fā)現(xiàn)選擴(kuò)引物組合 E-AT/M-CTG可擴(kuò)增到 1條在雄魚中出現(xiàn)率為100%、雌魚中出現(xiàn)率僅5%的條帶,該條帶長度約 141bp,但并不知道該片段的堿基序列,也未見有后續(xù)的研究報(bào)道。筆者在浙江養(yǎng)殖香魚中也得到1個雄性特異性AFLP條帶,擴(kuò)增該條帶的選擴(kuò)引物組合(E-ATG/M-CTG)與 Watanabe等(2004)的相比僅相差1個堿基,條帶大小也基本相同,因此筆者和 Watanabe等(2004)篩選到的香魚雄性特異性AFLP條帶應(yīng)是同一片段。測序顯示該雄性特異性條帶含139個堿基,但GenBank中未檢索到與該片段同源的序列。根據(jù)測得序列設(shè)計(jì)1對引物對10尾香魚的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,5尾雄魚中均擴(kuò)增到了目的片段,而5尾雌魚中均擴(kuò)增不到目的片段,這也使通過普通 PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)香魚遺傳性別的鑒定成為了可能,并可用于雌核發(fā)育、誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)以及單性全體繁育等研究。但該片段是否與香魚性別決定基因相連鎖、該片段所在染色體是否為香魚的性染色體等問題尚有待更進(jìn)一步研究。

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