王一雄(綜述),武忠炎(審校)
(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院骨科,烏魯木齊 830011)
周圍神經(jīng)損傷常導(dǎo)致局部感覺與運(yùn)動(dòng)功能障礙,而受損神經(jīng)連續(xù)性的恢復(fù)是神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的決定因素。目前常用的顯微手術(shù)修復(fù)和神經(jīng)移植等方法雖可恢復(fù)受損神經(jīng)的連續(xù)性,但均存在著諸多弊端,神經(jīng)再生及功能的恢復(fù)仍無法令人滿意[1]。神經(jīng)損傷后,修復(fù)目的是為了恢復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性,為神經(jīng)再生創(chuàng)造條件;而再生的成功與否取決于是否具有適合其生長的再生微環(huán)境。神經(jīng)營養(yǎng)因子等物質(zhì)成分是再生微環(huán)境中的重要因素,對再生神經(jīng)的生長和延伸起著十分重要的營養(yǎng)和誘導(dǎo)作用?;蚬こ碳夹g(shù)可將神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染到合適的靶細(xì)胞,再移植到受損神經(jīng)局部,為受損神經(jīng)提供適合再生的微環(huán)境所需的神經(jīng)營養(yǎng)因子,促進(jìn)神經(jīng)再生。因此,周圍神經(jīng)損傷的基因治療有著極大的應(yīng)用潛力。
神經(jīng)損傷后,損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端發(fā)生瓦勒變性,軸突及其髓鞘裂解并被巨噬細(xì)胞吞噬,隨后施萬細(xì)胞增殖形成Bungner帶并分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子,加上遠(yuǎn)端神經(jīng)變性后保留的基底膜管,構(gòu)成了受損神經(jīng)再生微環(huán)境,最終實(shí)現(xiàn)神經(jīng)再生。大量研究報(bào)道表明,神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)損傷后神經(jīng)細(xì)胞的存活、軸突發(fā)芽和延伸的過程中起著十分重要的營養(yǎng)和誘導(dǎo)作用[2-3]。此外,還有促神經(jīng)軸索生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)等物質(zhì)在微環(huán)境中對神經(jīng)再生起作用。由此可見,周圍神經(jīng)再生有賴于神經(jīng)營養(yǎng)因子的營養(yǎng)支持及細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜管構(gòu)成的微環(huán)境。
基因治療是將有特定功能的基因?qū)氚屑?xì)胞并植入受損神經(jīng)局部,使其表達(dá)并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),達(dá)到治療目的?;蛑委煹年P(guān)鍵是目的基因的選擇、載體工具的選擇及靶細(xì)胞的選擇。
2.1神經(jīng)營養(yǎng)因子和目的基因的選擇 神經(jīng)營養(yǎng)因子是由靶組織合成的一組可經(jīng)軸漿逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元胞體,并對其提供營養(yǎng)支持以及維持其存活的多肽類物質(zhì)。其作用機(jī)制為:通過與靶細(xì)胞表面特定種類的酪氨酸激酶受體結(jié)合,激活受體并通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生蛋白磷酸化作用,最后激活基因。神經(jīng)損傷后軸突的連續(xù)性中斷,神經(jīng)營養(yǎng)因子無法逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元胞體發(fā)揮作用,此時(shí)外源加入神經(jīng)營養(yǎng)因子可誘導(dǎo)再生的軸突沿神經(jīng)營養(yǎng)因子的濃度梯度生長并維持神經(jīng)元存活。神經(jīng)營養(yǎng)因子主要包括神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、睫狀神經(jīng)節(jié)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)素3、4/5、6、7等。此外,還有其他的神經(jīng)營養(yǎng)因子,如白細(xì)胞抑制因子、類胰島素生長因子、表皮生長因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β等。黃昭瑄等[4]用神經(jīng)生長因子治療糖尿病周圍神經(jīng)病變,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子是治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的一種安全、有效的藥物。鄭明輝等[5]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)纖維的再通及功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。王曉亮等[6]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),應(yīng)用堿性成纖維細(xì)胞生長因子-殼聚糖導(dǎo)管能有效修復(fù)周圍神經(jīng)損傷并使大鼠運(yùn)動(dòng)功能得到改善。周洪偉等[7]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),睫狀神經(jīng)節(jié)營養(yǎng)因子能顯著促進(jìn)大鼠視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞突起再生,且高濃度的睫狀神經(jīng)節(jié)營養(yǎng)因子能較早促進(jìn)突起再生。
近年來許多神經(jīng)營養(yǎng)因子基因得到克隆,通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù),將神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染到合適的受體細(xì)胞,再移植到損傷局部,使其向損傷局部提供神經(jīng)營養(yǎng)因子,為損傷神經(jīng)提供適合再生的微環(huán)境,促進(jìn)損傷神經(jīng)再生。Sorensen等[8]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),可通過腺病毒將神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因轉(zhuǎn)移至受損神經(jīng)的施萬細(xì)胞,使其有效表達(dá)來促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)。Gravel等[9]將攜帶腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和睫狀神經(jīng)節(jié)營養(yǎng)因子基因的重組腺病毒載體直接轉(zhuǎn)入大鼠損傷神經(jīng)的施萬細(xì)胞,使其有效表達(dá),促進(jìn)了神經(jīng)軸突的再生。此外,還有許多研究和報(bào)道表明,Ad-32Ep65-Flag基因、Bex-1(brain-expressed X-linked) 基因、Wld(S) (Wallerian degeneration slow) 變異基因、miR-1和miR-206基因、PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因等均可在周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)治療中發(fā)揮作用,促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生[10-15]。
2.2基因治療途徑與載體工具 基因治療有兩種基本途徑:①體內(nèi)直接基因治療或稱一步法(invivo):指將含外源基因的重組病毒、脂質(zhì)體或裸露的DNA直接導(dǎo)入體內(nèi)。一步法的優(yōu)點(diǎn)是無需中介細(xì)胞的參與、操作簡便、實(shí)用性強(qiáng)、更接近于臨床;弊端是該法尚不成熟,存在療效短、免疫排斥及安全性等問題。但一步法是基因轉(zhuǎn)載治療的研究方向,該法成熟與否決定了基因治療能否真正走上臨床;②體內(nèi)間接基因治療或稱二步法(exvivo):指將外源基因克隆至一個(gè)合適的載體,首先導(dǎo)入體外培養(yǎng)的有特定條件的細(xì)胞,經(jīng)篩選后將能表達(dá)外源基因的受體細(xì)胞重新輸回受試者體內(nèi)。該法較經(jīng)典、安全,而且易控制效果,但步驟繁瑣、技術(shù)難度大、不易推廣。
基因載體需含有可供目的基因表達(dá)的特定調(diào)控序列,包括病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體轉(zhuǎn)移效率高,但存在一些問題,如病毒產(chǎn)物的免疫原性、基因轉(zhuǎn)移靶向性以及基因表達(dá)的時(shí)間和水平等。目前常用的病毒載體有腺病毒載體、單純皰疹病毒相關(guān)載體、腺相關(guān)病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體。Hayashi等[16]研究了由腺病毒攜帶的人肝細(xì)胞生長因子對成年大鼠周圍神經(jīng)撕脫損傷的作用,發(fā)現(xiàn)腺病毒可作為周圍神經(jīng)損傷基因治療的有效載體。Dhar等[17]通過研究證實(shí)了單純皰疹病毒作為基因載體在組織工程學(xué)有廣闊的前景。反轉(zhuǎn)錄病毒由于其較高的致突變性以及不能感染非分裂細(xì)胞,因此將它用于治療神經(jīng)元損傷可能性較小。但通過導(dǎo)入自殺基因或編碼毒性因子的基因來治療腦腫瘤等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有較大的潛力,所以反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體治療神經(jīng)損傷有一定的前景,尚需深入研究。腺相關(guān)病毒是一種缺陷病毒,它可以靶向整合,能感染分裂和靜止細(xì)胞,現(xiàn)被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)基因治療中最有前途的高效載體。但因其裝載外源基因的容量有限,目前主要應(yīng)用于中樞神經(jīng)損傷的治療。非病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源基因不整合入宿主細(xì)胞的基因,不改變宿主細(xì)胞的基因組,但外源基因有效表達(dá)時(shí)間較短。目前主要應(yīng)用裸DNA注射法、電穿孔法、磷酸鈣沉淀、顯微注射法、脂質(zhì)體法等。
2.3靶細(xì)胞的選擇 基因工程所需的靶細(xì)胞是指能攝取外源基因并保持其穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞,要求有良好的分裂增殖能力、良好的促外源基因表達(dá)能力和良好的生物安全性。主要有施萬細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等。目前研究最多的是施萬細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.3.1施萬細(xì)胞 施萬細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷、再生與修復(fù)中起著關(guān)鍵作用,其作用主要有:①增殖形成Bungner帶,為再生軸突生長提供通道[18];②分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子,維持神經(jīng)元存活,促進(jìn)再生軸突生長;③分泌與神經(jīng)再生有關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)成分以及可引導(dǎo)軸突再生的黏附因子,為再生軸突提供良好的再生微環(huán)境,促進(jìn)神經(jīng)再生;④包繞再生軸突,形成無髓及有髓纖維、促進(jìn)再生軸突的成熟;⑤與再生軸突形成縫隙連接和緊密連接,直接與再生軸突進(jìn)行物質(zhì)交換。Hadlock等[19]用填充施萬細(xì)胞的聚合物植入神經(jīng)缺損處,發(fā)現(xiàn)可以顯著促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生。但有研究發(fā)現(xiàn),施萬細(xì)胞缺乏持續(xù)分泌再生軸突穩(wěn)定生長所需的神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)等物質(zhì)的能力[20-21]。增強(qiáng)施萬細(xì)胞分泌效應(yīng)的持續(xù)性成為影響神經(jīng)再生的關(guān)鍵。于志勇等[22]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),導(dǎo)入神經(jīng)生長因子基因的施萬細(xì)胞可在體內(nèi)長期存活并形成新的髓鞘,促進(jìn)軸突生長和損傷神經(jīng)的再生,為慢性神經(jīng)損傷的基因治療提供了新的方法。施新革等[23]提出轉(zhuǎn)染神經(jīng)生長因子3基因的施萬細(xì)胞移植于損傷的周圍神經(jīng),有促進(jìn)神經(jīng)生長、髓鞘再生的作用,能彌補(bǔ)單純細(xì)胞移植、神經(jīng)營養(yǎng)因子含量的不足。因此,施萬細(xì)胞可作為良好的基因受體靶細(xì)胞應(yīng)用于基因治療周圍神經(jīng)損傷。
2.3.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓中除造血干細(xì)胞外的另一種干細(xì)胞,來源豐富、有多向分化潛能、自我復(fù)制能力強(qiáng)、易于在體外獲得和擴(kuò)增、免疫原性低,且其獨(dú)特的細(xì)胞增殖模式使外源基因易于導(dǎo)入并表達(dá)。大量研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外及體內(nèi)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)組織的細(xì)胞,并能分泌多種利于神經(jīng)再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子,促進(jìn)軸突的再生和髓鞘形成[24-25]。Nie等[26]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與膠原混合后放入聚乳酸聚羥基乙酸共聚體管中,橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損,發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)神經(jīng)再生。黃世勇等[27]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),導(dǎo)入神經(jīng)生長因子基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在大鼠體內(nèi)存活并穩(wěn)定表達(dá)。所以,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可較好地作為基因工程的靶細(xì)胞應(yīng)用于周圍神經(jīng)損傷的治療。
基因工程技術(shù)在周圍神經(jīng)損傷治療的領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景,但許多研究尚處于基礎(chǔ)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,存在許多的不足,沒有廣泛應(yīng)用于臨床治療的條件,還存在一些問題亟待解決,如目的基因的高效持續(xù)表達(dá)的問題、基因轉(zhuǎn)染途徑的實(shí)用性問題、載體工具的安全性問題、靶細(xì)胞選擇的理想性問題以及基因轉(zhuǎn)移中的不良反應(yīng)問題等。相信隨著相關(guān)研究的不斷深入,基因工程技術(shù)會(huì)最終成為周圍神經(jīng)損傷的臨床治療的重要手段。
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