余琳，李小芳，冉茂蓮，羅丹，羅麗佳，李培培

甘草總黃酮為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖的提取物，甘草味甘、平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)。具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的功效。用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛等[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)甘草總黃酮具有明顯的抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗抑郁等作用[2]。果嘉等對甘草總黃酮的抗抑郁作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明甘草總黃酮具有抗大鼠慢性不可預(yù)測溫和應(yīng)激模型引起的行為抑郁作用，無中樞興奮的不良反應(yīng)，并且在較大劑量下能對應(yīng)激引起的海馬神經(jīng)再生損害起到保護(hù)作用，甘草苷的抗抑郁作用與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，可在一定程度上恢復(fù)HPA軸功能，增強免疫功能[3]，同時甘草總黃酮的鎮(zhèn)痛抗炎、免疫調(diào)節(jié)及保肝作用等可間接治療抑郁癥，甘草總黃酮在抑郁癥治療方面具有良好的發(fā)展前景。

1 材料與儀器

UV-6100紫外可見分光光度儀（上海美譜達(dá)儀器有限公司 ）； RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)； BP211D AG 型電子天平( 德國 Satorius)，UPT-I-10T 型超純水器( 成都超純科技有限公司)；DZG- 6020 型真空干燥箱( 上海森信實驗儀器有限公司)；ZRS-8G 智能溶出試驗儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）；85-2 型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；甘草苷對照品（批號：MUST-12082414）：購自曼斯特生物科技有限公司，甘草總黃酮(購自西安小草植物科技有限責(zé)任公司，純度為90%)，聚乙烯吡咯烷酮 K30（PVPK30成都市科龍化工試劑廠），PEG4000、HPMCK4M（成都科龍化工試劑廠）。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 甘草總黃酮骨架緩釋片的制備

原、輔料過100目篩，準(zhǔn)確稱取處方量的甘草總黃酮、HPMC K4M、PVP K30，用適量的乙醇溶解后，加入熔融的PEG4000中，攪拌揮去乙醇，干燥后粉碎，與填充劑混勻后加入適量潤滑劑，壓片即可，片子硬度控制在4～6 kg，片重約300 mg，每片含藥量約75 mg。

2.2 甘草總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液和供試品溶液的制備 精密稱取甘草苷對照品適量，用含1.0%十二烷基硫酸鈉（SDS）的pH6.8磷酸鹽緩沖液配制成0.1 g．L-1的對照品溶液即可。取不同時間點的溶出液10 mL，過0.45 μm 微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取“2.2.1”項下對照品溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL的10%KOH溶液顯色5 min，乙醇定容至刻度，在最大吸收波長337 nm處測定吸光度, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，甘草苷在5.0～30.0 μg．mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y=0.0275X+0.077（r=0.9995）。

2.3 溶出度測定

按照2010版中國藥典（二部）附錄XC溶出度測定的第二法槳法，以1000 mL pH6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 rpm進(jìn)行測定，溫度（37±0.5℃），分別于1,2,4,6,8,10,12 h各取樣10 mL （同時補加10 mL等溫溶出介質(zhì)），經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取5 mL顯色后定容至10 mL，在337 nm波長處測定吸光度，計算累積釋放百分率。

2.4 單因素試驗及結(jié)果

通過單因素試驗對HPMC規(guī)格、填充劑及潤滑劑進(jìn)行了篩選，結(jié)果HPMC K15M和HPMC K100M為緩釋材料，藥物前期釋放較緩慢，且釋放不完全，因此選擇HPMC K4M為緩釋材料?？疾炝宋⒕Юw維素、乳糖和可溶性淀粉對藥物體外釋放的影響，三種填充劑對藥物的體外釋放影響較小，微晶纖維素用量較大時，會出現(xiàn)前期釋放較快的現(xiàn)象，因此選擇乳糖為填充劑?？疾炝嘶?、硬脂酸鎂和微粉硅膠三種潤滑劑對藥物體外釋放的影響，結(jié)果其影響較小，以1%硬脂酸鎂為潤滑劑制得的片子表面光滑，最終選擇硬脂酸鎂為潤滑劑。

2.5 星點實驗設(shè)計

根據(jù)處方設(shè)計，以HPMC K4M含量、PVP K30含量及PEG4000含量為自變量，以2，6，10 h藥物累積溶出率的綜合評分Y值為因變量，每個因素設(shè) 5 水平，用代碼－α、－1、0、1、α來表示， 因素水平見表1。

表1 星點設(shè)計因素水平表

2.6 試驗結(jié)果及效應(yīng)面優(yōu)化

2.6.1 綜合評分Y值的計算 根據(jù)《中國藥典》2010版有關(guān)規(guī)定確定處方釋藥標(biāo)準(zhǔn)為：①緩釋片釋藥初期，即在1～2 h內(nèi)，其累積釋放度應(yīng)達(dá)到20%～30%，用以考察緩釋片是否有突釋；②緩釋片釋藥中期，即在4～6 h內(nèi)，其累積釋放度應(yīng)達(dá)到40～70%，用以確定緩釋片的釋藥特性；③緩釋片釋藥后期，即8～12 h內(nèi)，其累積釋放度應(yīng)達(dá)到80～100%，用以考察緩釋片釋藥是否完全。參考文獻(xiàn)[4]，設(shè)計綜合評分Y值為篩選指標(biāo)，即Y=Q10-[（Q2-30）2+（Q6-50）2]1/2，其中[（Q2-30）2+（Q6-50）2]1/2反映了2、6 h釋放度的偏差，值越小越好，10 h的釋放量應(yīng)大于80%，Q10應(yīng)越大越好，因此綜合評分Y值應(yīng)越大越好。

2.6.2 模型擬合 以綜合評分Y值為因變量對各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項式擬合，使用Design-Expert軟件擬合模型。

多元線性回歸方程為：

Y=68.461-1.646X1+0.148X2+2.360X3（P=0.08＞0.05，r=0.5798）。

二項式擬合方程為：

Y=-51.891+9.272X1-0.152X2+8.584X3-0.014X1X2+0.167X1X3+0.392X2X3-0.306X12-0.068X22-0.968X32（P=0.0002＜0.01，r=0.9604）。

試驗結(jié)果、方差分析見表2、3，結(jié)果顯示該模型具有高度的顯著性，方差的可信度及擬合度均較好，故可用此模型對甘草總黃酮緩釋片的處方進(jìn)行預(yù)測和分析。

表2 星點試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 甘草總黃酮緩釋片制備工藝方差分析

2.6.3 工藝優(yōu)化與預(yù)測 最優(yōu)處方：HPMC K4M占處方量15.42%，PVP K30 占處方量32.65%，PEG4000占處方量14.65%，預(yù)測綜合評分Y值為81.41。效應(yīng)面圖如下：

圖1 PVP K30和HPMC含量對Y值的影響

圖2 PEG4000和HPMC含量對Y值的影響

圖3 PEG4000和PVP K30含量對Y值的影響

2.6.4 驗證實驗 根據(jù)效應(yīng)面優(yōu)化的最佳處方進(jìn)行3批藥物溶出驗證實驗，3批驗證實驗的綜合評分Y值分別為79.91、79.33、80.44，平均值為79.89，二項式擬合方程預(yù)測值與實測值的偏差為1.61%，[偏差=(預(yù)測值-實測值) /預(yù)測值×100 % ] ，說明二項式擬合效果良好，可信度高，結(jié)果見表4。

表4 三批驗證實驗結(jié)果

2.7 甘草總黃酮體外釋藥模型擬合

分別以零級、一級和Higuchi方程對甘草總黃酮緩釋片的體外釋藥過程進(jìn)行模型擬合，結(jié)果表明甘草總黃酮緩釋片的體外釋藥符合Higuchi方程，釋藥機理為溶蝕和擴散相結(jié)合，以溶蝕釋藥為主，實驗結(jié)果見表5。

表5 甘草總黃酮緩釋片釋藥模型擬合

3 討論

臨床常用的抗抑郁藥物以西藥為主，長期服用副作用較大，患者順應(yīng)性差，因此從天然產(chǎn)物中尋找低毒高效的抗抑郁藥物是本領(lǐng)域的研究熱點。甘草總黃酮日服劑量較大，將其制備成緩釋片，可減少服藥次數(shù)。甘草總黃酮在水中的潤濕性及溶解性很差，制備緩釋片時藥物難以溶出，因此有必要采取相應(yīng)的增溶手段增加藥物的溶出，以確保藥物釋放完全，同時提高其體內(nèi)生物利用度。

在固體制劑中，目前對難溶性藥物的增溶方式主要有環(huán)糊精包合及固體分散，本課題預(yù)實驗考察了PVP K30、PEG4000、PEG6000及泊洛沙姆188對甘草總黃酮的增溶作用，四種載體均能不同程度的增加甘草總黃酮的溶解率，其中PVPK30和泊洛沙姆188的增溶作用較好，但泊洛沙姆制得的固體分散體不易干燥，且片劑制備較困難，PEG4000和PEG6000單獨使用，遇藥物黏性也較大，干燥成型困難，而PVPK30吸濕性較大，同時制得的固體分散體易出現(xiàn)老化現(xiàn)象，因此選用PVP K30和PEG4000為聯(lián)合載體，低黏度的HPMC K4M也常被用于難溶性藥物固體分散體的制備，其具有一定的抑晶作用，其親水凝膠性能可使藥物達(dá)到一定的緩釋效果。多種載體聯(lián)合使用制備固體分散體改善難溶性藥物的溶解性，可互相彌補單一載體存在的不足，目前在固體分散體的制備中應(yīng)用較多。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010版(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:80.

[2] 田慶來,官月平,張波,等.甘草有效成分的藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,14:343.

[3] 果嘉,趙偉鴻,樊紫周,等.甘草總黃酮抗抑郁作用研究[J].中藥藥理與臨床,2012,28(6):59.

[4] 向軍濤,蔣琳蘭.硝苯地平緩釋片的制備及其體外釋放度考察[J].中國藥房,2007,18(7):526.