何巧，陳思敏，王志華，何敏，諶立巍

穿心蓮內(nèi)酯為中藥穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees重要的藥效成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽、治療心腦血管疾病等多種作用[1～2]。其中有研究顯示穿心蓮內(nèi)酯抗菌作用范圍廣泛，對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等具有較強(qiáng)的抑菌作用，在臨床上具有良好的療效，并可有效降低銅綠假單胞菌毒力因子如綠膿菌素、胞外蛋白水解酶、彈性蛋白酶活性從而實(shí)現(xiàn)抗感染作用[3～4]。本課題組在前期的中藥抗菌有效成分研究的過程中，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可通過影響銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS），降低該菌的耐藥性發(fā)揮抗菌作用[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用小鼠腹腔感染銅綠假單胞菌PAO1，考察穿心蓮內(nèi)酯配比左氧氟沙星的體內(nèi)抗感染作用，為將該藥物開發(fā)成抗菌藥物增效劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌種

銅綠假單胞菌PAO1野生株（Pseudomonasaeruginosa O1，PAO1）由中國科學(xué)院上海藥物研究所贈(zèng)送。原始菌種保存于-20℃冰箱（甘油保存）；試驗(yàn)前菌種于M-H(A)平板復(fù)活后，選取長勢良好的單一菌團(tuán)涂抹于M-H(A)斜面，35℃隔夜孵育后密封，4℃冷藏保存?zhèn)溆茫辉囼?yàn)前一天取斜面菌涂抹于M-H(A)平板，35℃孵育過夜，即可使用。

1.2 試藥

穿心蓮內(nèi)酯（四川禾嘉華福寧制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：cxltqw20110528），經(jīng)高效液相色譜（HPLC）鑒定，純度高于99%；左氧氟沙星（上虞京新藥業(yè)，生產(chǎn)批號(hào)：DK20-1202093），經(jīng)經(jīng)銷廠家HPLC測定后，純度達(dá)97.4%，符合實(shí)驗(yàn)要求；M-H(A)和M-H(B)培養(yǎng)基（OXOID公司，CM0337A和CM0405B）；其他耗材均由成都雅榮生化設(shè)備經(jīng)營部購買提供。

1.3 儀器

全波長多功能讀數(shù)儀（Thermo 公司）；MILLIPORE Synergy超純水儀（Milipore公司）；超凈工作臺(tái)（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；低溫冷凍離心機(jī)Sorvall ST 16R（Thermo Fisher）。

1.4 動(dòng)物

SPF級(jí)KM種小白鼠，18-22 g，雌雄各半，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（生產(chǎn)合格證號(hào)：川實(shí)動(dòng)質(zhì)管第005號(hào)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào)：川實(shí)動(dòng)質(zhì)管第022號(hào)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯的協(xié)同抗感染作用

2.1.1 復(fù)制小鼠PAO1腹腔感染模型 將保存于斜面的銅綠假單胞菌PAO1 35℃隔夜孵育復(fù)活，挑3～4個(gè)單菌落溶于4 mL M-H(B)培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)菌濃度為0.5麥?zhǔn)希?.5×108CFU．mL-1）濃度，并稀釋定容至40 mL；用無菌吸管反復(fù)吹打使細(xì)菌均勻混懸后將菌液隔夜增菌培養(yǎng)16 h（35℃，空氣搖床振搖16 h），次日取出原菌液測OD值（細(xì)菌生長飽和期）。取20 mL,分裝于離心管中，每管2 mL，離心（10000～15000 rpm．min-1，10 min），棄上清液，用2 mL生理鹽水混勻后，再離心（15000 rpm．min-1，10 min），棄上清液；再在離心管中加入生理鹽水2 mL，用吸管充分混勻后收集細(xì)菌細(xì)胞菌體2 mL，設(shè)定該菌液為100菌液濃度，用0.5%的滅菌胃膜素（mucin）進(jìn)行稀釋，稀釋至10-1，10-2，10-3，10-4備用。取體重18～22 g的小鼠，隨機(jī)分組，每組8只，分別ip 注射上述菌液至小鼠體內(nèi)，0.5 mL/只。觀察記錄各組小鼠24 h死亡情況，以致小鼠90%～100%死亡的最低感染菌量做為最小致死菌量（MLD）。結(jié)果顯示10-2為最佳劑量，以該菌量做為體內(nèi)感染的菌量復(fù)制小鼠感染模型。

2.1.2 摸出給藥的合適劑量范圍 得出銅綠假單胞菌MLD后，以左氧氟沙星的臨床指定劑量計(jì)算小鼠給藥劑量，并以該劑量為最高劑量，再10倍稀釋左氧氟沙星共獲得6個(gè)劑量，再分別灌胃給予小鼠不同劑量的左氧氟沙星，摸出致感染細(xì)菌的小鼠出現(xiàn)0%～100%存活（或者死亡）的給藥劑量范圍。選擇小鼠存活率為40%～50%時(shí)左氧氟沙星劑量。結(jié)果顯示左氧氟沙星的最佳劑量為0.2 mg．kg-1。

2.1.3 穿心蓮內(nèi)酯和左氧氟沙星配比劑量范圍 以2.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，將左氧氟沙星的劑量固定為0.2 mg．kg-1，選擇4個(gè)較佳配合穿心蓮內(nèi)酯的組合為受試藥物.具體見表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯配比左氧氟沙星劑量

2.1.4 體內(nèi)保護(hù)性實(shí)驗(yàn) 取健康KM小鼠，體重18～22 g，隨機(jī)分組，每組50只鼠，雌雄各半，分別腹腔感染1 MLD菌量的受試菌液，0.5 mL/只，感染后即刻灌胃給予不同受試藥物，僅給一次，給藥后觀察并記錄各給藥組小鼠的死亡數(shù)（或存活數(shù)），連續(xù)觀察3天（72 h）。同時(shí)設(shè)感染對照組及空白對照組。

2.1.5 統(tǒng)計(jì)處理 根據(jù)各組小鼠死亡數(shù)（或存活數(shù)）用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件17.0，采用X2方法統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2.1.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 具體見表2。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總體顯示左氧氟沙星配比一定劑量穿心蓮內(nèi)酯，有提高左氧氟沙星體內(nèi)抗感染保護(hù)作用的趨勢，且在配合穿心蓮內(nèi)酯0.28×10-3時(shí)，藥物的體內(nèi)保護(hù)作用要優(yōu)于單獨(dú)使用左氧氟沙星（p＜0.05），提示穿心蓮內(nèi)酯可增強(qiáng)銅綠假單胞菌對左氧氟沙星的敏感性。

表2 穿行連內(nèi)酯配比左氧氟沙星對PAO1腹腔感染模型的體內(nèi)保護(hù)作用

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌PAO1 24 h生長速率的影響

2.2.1 樣品配制 稱取穿心蓮內(nèi)酯300 mg，加入3 mL二甲基亞砜（DMSO）配成100 mg．mL-1的穿心蓮內(nèi)酯DMSO溶液。吸取1 mL 100 mg．mL-1的藥液加入9 mL DMSO得10 mg．mL-1的藥液，依次配制1、0.1、0.01、0.001 mg．mL-1的藥液。將4℃冷藏保存的PAO1轉(zhuǎn)染至M-H(A)平板上隔夜培養(yǎng)。將長勢良好的1～2個(gè)傳代菌落用生理鹽水調(diào)至菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞舛?。精密量?0 μL藥液與9.98 mL M-H（B）培養(yǎng)基均勻混合，裝于消毒試管中，再精密吸取10 μL菌液，渦旋儀充分混勻受試樣本。分別吸取200 μL加入96孔板中，每組8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)僅加入相同劑量DMSO空白對照組（組7）和僅加入培養(yǎng)基的空白對照組（組8）。具體見表3。

表3 試管基質(zhì)中菌量和各組藥物含量

2.2.2樣品檢測 將加有樣本的96孔板在35℃培養(yǎng)箱中孵育，每隔1h，取樣品在420 nm全波長多功能酶標(biāo)儀下測OD值。將空白組各孔OD值取平均值，設(shè)為OD0。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 記錄各組數(shù)據(jù)，每組取平均值，各組OD值減去OD0作為該組OD值。并作圖表示。

2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯各組生長曲線與DMSO空白組之間無差異具體見圖1。提示穿心蓮內(nèi)酯不影響PAO1的生長，且DMSO對PAO1無影響。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌24h內(nèi)生長的影響

3 討論

抗生素長期應(yīng)用導(dǎo)致臨床有效率不斷降低，而且藥物的大量使用還可誘導(dǎo)細(xì)菌的高度耐藥和多重耐藥的產(chǎn)生，所以臨床相關(guān)感染的治療變得非常棘手。長期的臨床實(shí)踐證實(shí)中藥在細(xì)菌感染性疾病治療方面具有明確的療效，穿心蓮是清熱解毒中藥中的代表之一，長期用于細(xì)菌感染的治療，療效確切。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是臨床上獲得性感染的重要條件致病菌，常引起呼吸道感染、菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、燒傷感染和囊性纖維化繼發(fā)感染等多種疾病[6]。近年來，由于大量強(qiáng)效抗菌藥物的廣泛使用，使該菌種呈現(xiàn)出天然或獲得性多重耐藥,造成難以治愈的嚴(yán)重感染[7]。本實(shí)驗(yàn)通過建立銅綠假單胞菌PAO1小鼠腹腔感染模型，以動(dòng)物死亡率為指標(biāo)考察藥物的體內(nèi)保護(hù)作用。結(jié)果顯示在一定的配比劑量下，加入了穿心蓮內(nèi)酯的左氧氟沙星普遍表現(xiàn)出保護(hù)性作用增強(qiáng)；但是通過測定24 h細(xì)菌生長曲線，顯示穿心蓮內(nèi)酯沒有直接影響細(xì)菌生長的作用。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和目前穿心蓮內(nèi)酯的抗菌作用研究進(jìn)展，提示穿心蓮內(nèi)酯在體內(nèi)可能還通過其它途徑發(fā)揮抗菌協(xié)同作用。

[1] 楊靜.穿心蓮內(nèi)酯的研究進(jìn)展[J].中草藥,2009,40(7):1168.

[2] 史傳英,董六一.亞硫酸氫鈉穿心蓮內(nèi)酯的抗炎解熱鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國民族民間醫(yī)藥,2009,18(12):5.

[3] 李洪濤,吳春民,覃慧敏,等.穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌PAO1株MexAB-OprM外排泵mRNA表達(dá)的影響[J].中華傳染病雜志,2007,25(6):338.

[4] 李洪濤,覃慧敏,王衛(wèi)華,等.穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌QS毒力因子的影響[J].中國中藥雜志,2006,31(12):1015.

[5] 陳思敏,諶立巍,何敏,等.穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌PAO1生物被膜形成的及對lasR/rhlR表達(dá)的調(diào)控機(jī)制[J].中藥與臨床2014,30(2):24.

[6] Lisa S,Jane S.Infection control in cystic fibrosia[J].Clin Microbiol Rev.2004,17(1):57.

[7] Nathan EH,Hongwei Y.Cross-sectional analysis of clinical and environmental isolates of Pseudomonas areuginosa:biofilm formation,virulence,and genome diversity[J].Infect Immun,2004,72(1):133.