胡媛，趙梓辰，楊昌林，劉友平

赤芍為歷版《中國藥典》收載品種，來源于毛茛科植物芍藥Paeonia lactifioraPall. 或川赤芍Paeonia veitchiiLynch的干燥根。味苦，微寒，歸肝經(jīng)，清熱涼血，散瘀止痛，用于熱入營血，溫毒發(fā)斑，吐血衄血，目赤腫痛，肝郁脅痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，癓瘕腹痛，跌撲損傷，癰腫瘡瘍，為臨床常用中藥材。芍藥有野生品和栽培品，傳統(tǒng)認(rèn)為赤芍以野生的芍藥根曬干入藥為好；而栽培芍藥一般去皮后煮熟，暴曬至干，作白芍藥用。但由于近年野生芍藥資源的急劇下降，市場(chǎng)上出現(xiàn)栽培芍藥的細(xì)小根直接干燥作為赤芍藥用的現(xiàn)象，其科學(xué)性和合理性還有待深入研究。

現(xiàn)代研究表明，單萜苷中的芍藥苷是芍藥的主要有效成分[1～3]，具有抗自由基損傷、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載和抗神經(jīng)毒性等活性、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，而芍藥中的苯甲酸[4～5]，會(huì)增加肝臟的解毒負(fù)擔(dān)，攝入一定量會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，其對(duì)機(jī)體有致突變作用，可能導(dǎo)致非免疫型接觸性蕁麻疹及非免疫直接接觸反應(yīng)，如風(fēng)疹、紅斑、瘙癢癥等，被認(rèn)為是芍藥中的有害成分，實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，由于芍藥中的單萜苷類成分含有苯甲?；谝欢l件下可水解為大量的苯甲酸。為了客觀檢測(cè)赤芍商品藥材中芍藥苷與苯甲酸的真實(shí)含量，本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定34批芍藥藥材（22批來源于栽培芍藥，12批來源于野生芍藥）中芍藥苷與苯甲酸的含量，為栽培芍藥當(dāng)赤芍藥用的合理性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀島津LC10-ATVP，CLASS-VP工作站；色譜柱為Hypersil ODS（200mm×4mm，5μm，大連依利特分析儀器有限公司)；電子分析天平BP211D（十萬分之一），BP121S（萬分之一）（德國Sartouris股份有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；BUG25-12超聲波清洗機(jī)（上海必能信公司）。

1.2 材料與試劑

芍藥苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110736-200732）；苯甲酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100419-200301）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；其余試劑為分析純。

1.3 藥材

赤芍藥材樣品編號(hào)及來源見表1。

表1 赤芍藥材樣品收集和鑒定表

SYZ-19 P.lactifiora Pall. 四川中江縣籍慶鎮(zhèn) 根莖(自采)SYZ-20 P.lactifiora Pall. 四川中江縣石泉鄉(xiāng) 根莖(自采)SYZ-21 P.lactifiora Pall. 四川中江縣石泉鄉(xiāng) 根莖(自采)SYZ-22 P.lactifiora Pall. 成都中醫(yī)藥大學(xué)峨眉校區(qū)GAP基地 根莖(自采)

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷和苯甲酸對(duì)照品各5 mg、2.5 mg，精密稱定，分別置10 mL、25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得含芍藥苷0.504 mg．mL-1和含苯甲酸0.105 mg．mL-1的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。從中分別精密量取芍藥苷與苯甲酸對(duì)照品儲(chǔ)備液各5 mL、2 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得含芍藥苷252 μg．mL-1和含苯甲酸21 μg．mL-1的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取赤芍細(xì)粉（過三號(hào)篩）0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水-甲酸（95∶5）10 mL，稱重，浸泡2 h，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，用水-甲酸（95∶5）補(bǔ)足減失的重量，過濾，收集續(xù)濾液，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱Hypersil-ODS C18(4.6×200 mm,5 μm)，流動(dòng)相甲醇-0.1%磷∶酸水（27∶73），流速1.0 mL．min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長230 nm。在上述條件下，芍藥苷與苯甲酸完全分離，色譜圖見圖1、圖2。以芍藥苷峰計(jì)算理論塔板數(shù)為8000。

圖1 芍藥苷與苯甲酸混合對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 芍藥樣品測(cè)定芍藥苷與苯甲酸含量HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品溶液，采用逐級(jí)稀釋法，得含芍藥苷15.75 μg．mL-1、31.5 μg．mL-1、63 μg．mL-1、126 μg．mL-1、252 μg．mL-1和含苯甲酸1.3125 μg．mL-1、2.625 μg．mL-1、5.25 μg．mL-1、10.5 μg．mL-1、21 μg．mL-1對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱座標(biāo)，芍藥苷（或苯甲酸）（μg）為橫座標(biāo)，進(jìn)行回歸，得芍藥苷回歸方程y=1×106x-23310，R2=0.9997，芍藥苷在0.315～5.040 μg．mL-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；得苯甲酸回歸方程y=5×106x+8881.4，R2=0.9998，苯甲酸在0.02625～0.42000 μg．mL-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定峰面積，結(jié)果表明芍藥苷的RSD為1.21%，苯甲酸的RSD為1.56%，用本方法進(jìn)樣精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取芍藥供試品溶液，分別于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h測(cè)定峰面積，結(jié)果表明芍藥苷的RSD為2.01%，苯甲酸的RSD為2.27%，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取芍藥6份，制備供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄色譜圖，并計(jì)算含量，結(jié)果表明芍藥苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.80 mg ．g-1，RSD為2.52%；苯甲酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.504 mg．g-1，RSD為2.74%，該方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

取芍藥6份，每份0.05 g，精密稱定，兩份一組，各組分別加入芍藥苷對(duì)照品溶液（1.274 mg．mL-1）2.0 mL、2.4 mL、2.8 mL，苯甲酸對(duì)照品溶液（0.0250 mg ．mL-1）0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，揮去溶劑，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備中從“置具塞錐形瓶中…”開始制備供試品溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2、表3。

表2 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表3 苯甲酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3 0.0501 0.025 0.025 0.051 103.06 102.15 2.73 4 0.0503 0.025 0.025 0.051 103.07 5 0.0502 0.025 0.030 0.056 103.09 6 0.0504 0.025 0.030 0.054 96.54

結(jié)果表明：芍藥苷平均回收率為97.02%，RSD為1.34%，苯甲酸平均回收率為102.15%，RSD為2.73%，該方法準(zhǔn)確度良好。

2.8 樣品含量測(cè)定

分別取供試品溶液及混合對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 34批赤芍商品藥材中芍藥苷與苯甲酸含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

由上表可知，上述34批芍藥商品藥材中有33批藥材符合《中國藥典》2010版的規(guī)定（芍藥苷含量＞18.0 mg．g-1）。栽培芍藥和野生芍藥的芍藥苷含量采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中非參數(shù)檢驗(yàn)（兩樣本秩和檢驗(yàn)，Mann-Whitney U），得到P=0.007＜0.05，說明二者存在顯著性差異；對(duì)栽培芍藥和野生芍藥的苯甲酸含量采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中非參數(shù)檢驗(yàn)（兩樣本秩和檢驗(yàn)，Mann-Whitney U），得到P=0.000＜0.05，說明二者存在顯著性差異。

3 討論

本試驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定芍藥藥材中芍藥苷與苯甲酸含量，該法重復(fù)性好，可靠性強(qiáng)，對(duì)栽培的芍藥當(dāng)赤芍藥用的合理性研究具有重要意義。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)采用的22批栽培芍藥中有21批藥材符合《中國藥典》2010版的規(guī)定（芍藥苷含量＞18.0 mg．g-1），說明栽培芍藥當(dāng)做赤芍藥用具有一定的可行性和合理性，但是栽培芍藥和野生芍藥的芍藥苷和苯甲酸含量都存在顯著性差異，說明栽培芍藥和野生赤芍在一定程度上不具有質(zhì)量等同性，栽培芍藥代替野生芍藥當(dāng)做赤芍藥用還需要結(jié)合其他化學(xué)成分和藥理作用的比較進(jìn)行深入研究。

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