李 曉 孟秀秀 陳衛(wèi)衛(wèi) 李 鵬 孫賀男 任洋洋 高 偉

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木耳干耳片組織分離的新方法研究*

李 曉 孟秀秀 陳衛(wèi)衛(wèi) 李 鵬 孫賀男 任洋洋 高 偉

（食藥用菌教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118）

木耳；組織分離；干耳片

黑木耳子實(shí)體新鮮時(shí)半透明膠質(zhì)，富有彈性，呈耳狀、葉片狀或不規(guī)則形；干燥后收縮成革質(zhì)，較薄，有一定韌性[1]。菌種生產(chǎn)時(shí)不易進(jìn)行組織分離。傳統(tǒng)組織分離方法多以新耳，或用水泡開的干耳作為材料[2]。操作方法繁瑣而又極易污染，且多使用氯化汞試劑，不僅對(duì)環(huán)境造成污染，對(duì)木耳也有一定的不良影響。我們通過實(shí)踐，摸索出兩種以干耳片為組織分離材料的實(shí)用、有效方法，在一定程度上彌補(bǔ)了上述缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）木耳。黑木耳單片品種吉Au01，選取較平整、邊緣褶皺、少筋的干耳片作為分離材料。耳片采取自然陰干、曬干，或于35 ℃以下烘干。

（2）煙霧熏蒸氣霧消毒劑。選用小袋裝的粉末狀煙霧熏蒸氣霧消毒劑，每小袋約8 g，每次用一袋。

（3）罐頭瓶。選擇大口玻璃制罐頭瓶，瓶體無破損。

（4）培養(yǎng)基。采用PDA斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮，無芽）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～18 g（或瓊脂條20 g），水1 000 mL。培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌30 min后，待溫度降至55～60 ℃時(shí)出鍋擺斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織分離方法

（1）熏干耳片組織分離方法。先將選取的耳片用回形針固定在兩層塑料膜中央，再將第三層塑料膜覆蓋在前兩層塑料膜的外側(cè)。將煙霧熏蒸氣霧消毒劑點(diǎn)燃后迅速放入大口罐頭瓶?jī)?nèi)，然后將干耳片懸掛于瓶中央，用皮圈將塑料膜固定于瓶口，并封牢。待罐頭瓶?jī)?nèi)無煙后用75％的酒精棉擦拭瓶表，置于已滅菌的超凈工作臺(tái)上。用經(jīng)75％酒精棉消毒后的手將熏過的干耳片從回形針上取下，固定在回形針的一端，用灼燒滅菌冷卻后的鑷子夾取遠(yuǎn)離手持端的不卷曲的耳片，大小如芝麻，放入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，塞上棉塞或硅膠塞，在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以上操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精燈火焰附近進(jìn)行。

（2）熏干耳片泡酒精組織分離方法[3]。在進(jìn)行組織分離操作前，準(zhǔn)備兩個(gè)培養(yǎng)皿，在超凈工作臺(tái)內(nèi)向培養(yǎng)皿中加入75％酒精，約為培養(yǎng)皿總體積的1/2。然后再對(duì)超凈工作臺(tái)進(jìn)行紫外線滅菌。

將干耳片按照熏干耳片組織分離方法，移在超凈工作臺(tái)進(jìn)行。夾取芝麻粒大小的耳片，先放入第一個(gè)培養(yǎng)皿中浸泡1 min，然后用鑷子夾到第二個(gè)培養(yǎng)皿中來回涮2～3次，再用鑷子夾著從酒精燈火焰上穿梭（在穿過酒精燈火焰時(shí)，木耳組織塊會(huì)著火，屬正?，F(xiàn)象）后放入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，塞上試管塞。在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

兩種木耳組織分離方法的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 木耳組織分離試驗(yàn)結(jié)果

分離成功率是指每個(gè)耳片分離出純培養(yǎng)物的幾率。表1中數(shù)據(jù)是分別以一個(gè)干耳片為分離材料進(jìn)行操作所得數(shù)據(jù)，所以耳片分離的成功率均為100％。

熏干耳片組織分離方法：干木耳塊在吸收培養(yǎng)基內(nèi)水分后膨脹，3～4天萌發(fā)；熏干耳片泡酒精組織分離方法，2～3天萌發(fā)。說明添加酒精對(duì)木耳塊的萌發(fā)有促進(jìn)作用。熏干耳片法10支試管培養(yǎng)時(shí)有2支試管既不萌發(fā)也未污染，這可能是熏蒸時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致的。在培養(yǎng)過程中污染的雜菌，種類較單一，都為細(xì)菌。說明以上兩種組織分離方法可以有效抑制真菌類雜菌污染。

3 結(jié)論與討論

在熏干耳片組織分離方法的操作中，不可以隨意增加煙霧熏蒸氣霧消毒劑的用量，否則會(huì)熏死木耳，引起分離失敗。在熏干耳片泡酒精組織分離方法的操作中，過酒精燈火焰的木耳塊著火后應(yīng)立刻放入培養(yǎng)基內(nèi)，不可以在外部空間停留過長(zhǎng)時(shí)間，否則會(huì)燒死木耳。此兩種方法只適合以干耳片為分離材料。如果操作中用鮮耳或泡開的干耳，在熏蒸過程中會(huì)使耳片發(fā)黃死亡。由于耳片在曬干過程中會(huì)殺死部分雜菌，因此以干耳片為分離材料，可降低耳片本身的雜菌基數(shù)。

熏干耳片組織分離方法中，罐頭瓶中的耳片不可以碰壁。對(duì)罐頭瓶用氣霧消毒劑熏蒸并封口，可建立一個(gè)密閉的無菌環(huán)境。所用的煙霧熏蒸氣霧消毒劑經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，其有效成分為有機(jī)氯，避免了重金屬污染。

試驗(yàn)過程污染的雜菌均為細(xì)菌?？煽紤]在分離培養(yǎng)基中加100 μg/mL的青霉素，以減少培養(yǎng)基的細(xì)菌污染[4]。

[1] 李玉, 圖力古爾. 長(zhǎng)白山蘑菇[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2003: 77.

[2] 黃毅. 食用菌栽培[M]. 北京: 高等教育出版社, 2008: 85.

[3] 杜萍, 崔寶凱. 木耳菌種分離新方法簡(jiǎn)介[J]. 食用菌, 2009(6): 27-28.

[4] 戴水蓮, 林警, 高麗. PDA中加入抗菌素的抗菌作用試驗(yàn)[J]. 食用菌, 2008, 30(1): 28-29.

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系“北方野生菌收集保育與馴化”（GARS-24）；吉林省重大項(xiàng)目“作物秸稈與畜禽糞便高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)食用菌的關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（10ZDGG003）

李曉（1976—），男，副教授，從事食用菌教學(xué)、科研和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)等工作。

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2095-0934（2014）03-151-02