宋江偉，田 宏，吳錦艷，陳 妍，尚佑軍，劉湘濤

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州730046）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，是嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病［1］。豬瘟病毒為單股正鏈RNA病毒，基因組編碼一個由3 898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，在細胞和病毒的蛋白酶作用下加工產(chǎn)生12個蛋白終產(chǎn)物，即Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B。其中，NS3為2 049個堿基編碼的683個氨基酸殘基組成的非結(jié)構(gòu)蛋白。NS3蛋白是一個多功能酶蛋白，具有絲氨酸蛋白酶（serine protease）活性、核苷三磷酸酶（triphosphatase，NTPase）活性和RNA激活的解旋酶（RNA helicase）活性［2-3］，絲氨酸蛋白酶負責加工病毒多聚蛋白使之產(chǎn)生成熟的病毒蛋白，核苷三磷酸酶和解旋酶與病毒的復制相關(guān)［4-5］。此外，NS3蛋白在病毒與宿主細胞的相互作用中也扮演了一個十分重要的角色［6］。Qi F等［7］認為 NS3蛋白直接或間接地作用于一些重要的蛋白質(zhì)，造成宿主或體外培養(yǎng)細胞損傷，并且NS3蛋白在豬瘟病毒的感染過程發(fā)揮著極為重要的作用，直接參與病毒損傷細胞的過程。

本研究以豬瘟病毒NS3蛋白為研究對象，將其與酵母表達載體pGBKT7重組在一起構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-NS3，對構(gòu)建的誘鉺載體進行pGBKT7-NS3毒性和自激活性的檢測，以期為從細胞cDNA文庫中篩選與其相互作用的蛋白研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 豬瘟病毒石門株的血液樣品，由國家口蹄疫參考實驗室保存；Trizol為invitrogen公司產(chǎn)品；PrimeScript One-Step RNA PCR Kit、各種內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DH5α感受態(tài)細胞、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System、YPDA培養(yǎng)基、SD各種缺陷性培養(yǎng)基、酵母菌株 Y2HGold、X-α-gal、Aureobasidin A、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、c-Myc抗體為Clontech公司產(chǎn)品；HRP標記的羊抗鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.2 引物合成和設(shè)計 根據(jù)GenBank上豬瘟病毒石門株（登錄號：AF092448.2）序列，使用DNA Star軟件設(shè)計擴增NS3基因片段的引物，并在上、下游引物5′端設(shè)計NdeⅠ，SalⅠ酶切位點（下劃線處），預計擴增產(chǎn)物長度為2 049bp。上游引物P1：5′-CATATGGGGCCTGCCGTTTGCAA-3′下游引物P2：5′-GTCGACTAGACCAACTACTTGTTTTAGTGCT-3′。引物合成及序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 豬瘟病毒NS3基因片段的擴增 取400μL豬瘟病毒石門株血毒，采用Trizol法提取總RNA。50μL RT-PCR反應(yīng)體系：10×One-step RNA PCR buffer 5μL，MgCl210μL，d NTP Mixture 5μL，RNase inhibitor 1μL，AMV RTase XL 1μL，AMV-optimited Taq 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，RNA模版3μL，RNase free water 22μL。One-step RT-PCR反應(yīng)條件：50℃30min；94℃3min，94℃50s；55℃ 1min；72 ℃ 90s，30個循環(huán)；72℃10min。

1.2.2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NS3的構(gòu)建與鑒定 使用NdeⅠ和SalⅠ雙酶切RT-PCR回收產(chǎn)物和誘餌載體pGBKT7，回收純化后使用T4DNA連接酶將酶切后的NS3與pGBKT7 4℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細胞中，涂布于 Kan（50μg/mL）抗性LB固體平板上培養(yǎng)直到有菌落出現(xiàn)，再挑單菌落接到Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，搖床上37℃過夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒做雙酶切鑒定并將陽性質(zhì)粒送測序驗證。

1.2.3 制備酵母感受態(tài)細胞，誘餌載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 酵母感受態(tài)細胞用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法制備，將凍存的Y2HGold劃線接種至YPDA平板，倒置30℃培養(yǎng)3d，挑取一單菌落于3mL YPDA培養(yǎng)基中，30℃、250r/min振搖8h～12h，取5μL接種于50mL YPDA培養(yǎng)基中，30℃、250r/min振搖16h～20h，當OD 600nm＝0.15～0.3，室溫下，700g離心5min棄上清，沉淀重懸于100mL YPDA中，30℃孵化3h～5h直到OD 600nm＝0.4～0.5，把培養(yǎng)基分到2個50mL錐形管中，室溫下700r/min離心5min棄上清，沉淀重懸于30mL去離子水中，再室溫下700g離心5min棄上清，沉淀重懸于1.5mL TE/LiAc中，轉(zhuǎn)移細胞懸浮液到2個1.5mL離心管中高速離心15s，棄上清，用600μL 1.1×TE/LiAc重懸細胞。制備的感受態(tài)細胞立即使用。

在預冷的無菌1.5mL離心管中加入pGBKT7-NS3質(zhì)粒100ng，變性的Yeastmaker Carrier DNA 5μL、酵母感受態(tài)細胞50μL，輕輕混勻后加入500μL PEG/LiAc，30℃培養(yǎng)30min，每10min輕輕渦旋振蕩，加入20μL DMSO混勻后放入水浴15min，每10min輕輕渦旋振蕩1次，高速離心15s后棄上清，重懸于1mL YPD plus Medium，高速離心15s后移去上清，用1mL 9g/L NaCl重懸感受態(tài)細胞，將菌液分別按1∶10和1∶100稀釋后鋪于SD/-Trp營養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)3d～5d。

1.2.4 Western blot驗證誘餌載體在酵母中的表達 參照酵母蛋白提取手冊（Yeast Protocol Handbook，Clontech）提取誘餌蛋白，進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，BSA常溫封閉4h，加入一抗c-Myc常溫孵育4h，洗滌后再加入二抗常溫孵育2h，之后再用DAB顯色。

1.2.5 誘餌載體pGBKT7-NS3毒性和自激活性的檢測 將100ng的pGBKT7空載體和誘餌載體pGBKT7-NS3分別轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細胞中，分別平鋪100μL、1/10、1/100稀釋度轉(zhuǎn)化pGBKT7空載體和誘餌載體pGBKT7-NS3的酵母細胞到SD/-Trp平板上。再平鋪100μL、1/10、1/100稀釋度轉(zhuǎn)化誘餌載體的酵母細胞混合物到SD/-Trp、SD/-Trp/x-α-gal和SD/-Trp/x-α-gal/AbA 平板上，轉(zhuǎn)化pGBKT7-53和pGADT7-T到酵母感受態(tài)細胞后平鋪到SD/-Leu/-Trp/x-α-gal/AbA 平板上，30℃倒置培養(yǎng)3d后觀察比較菌落生長狀況。

2 結(jié)果

2.1 豬瘟病毒NS3基因片段的RT-PCR擴增

PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測得到一條清晰特異性條帶，大小約2 049bp，與預期片段大小一致（圖1），說明從血液中成功擴增到豬瘟病毒NS3基因片段。

圖1 豬瘟病毒NS3的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of CSFV-NS3gene

2.2 誘餌載體pGBKT7-NS3的雙酶切分析

重組質(zhì)粒用NdeⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后電泳分析，得到約7 300bp和2 049bp大小片段，與預期結(jié)果一致。測序結(jié)果證明NS3基因插入的位置、方向、大小和讀碼框均正確?？捎糜诤罄m(xù)試驗（圖2）。

2.3 誘餌載體pGBKT7-NS3的表達鑒定

提取pGBKT7-NS3的酵母菌蛋白，經(jīng)Western blot分析，可見融合蛋白表達，融合蛋白分子大小約為80ku，與預期結(jié)果一致，說明該誘餌載體可用于酵母雙雜交篩選與NS3相互作用的蛋白（圖3）。

2.4 誘餌載體pGBKT7-NS3的毒性和自激活性檢測分析

將pGBKT7空載體和誘餌載體pGBKT7-NS3分別轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細胞，分別平鋪100μL、1/10、1/100稀釋度轉(zhuǎn)化的酵母細胞到SD/-Trp平板上，30℃倒置培養(yǎng)3d后，含有空載體和誘餌載體的菌落大小，顏色和克隆數(shù)基本一致，說明誘餌載體pGBKT7-NS3對酵母Y2HGold感受態(tài)細胞沒有毒性。轉(zhuǎn)化誘餌載體pGBKT7-NS3的Y2H酵母菌在SD/-Trp培養(yǎng)板上為白色菌落，在SD/-Trp/x-α-Gal培養(yǎng)板上為白色菌落，在SD/-Trp/xα-Gal/AbA培養(yǎng)板上無菌落生長，含有2個pGBKT7-53和pGADT7-T質(zhì)粒的陽性對照在SD/-Leu/-Trp/x-α-gal/AbA平板上為藍色菌落，由此證明誘餌質(zhì)粒無自我激活能力，可用于酵母雙雜交篩選與豬瘟病毒NS3蛋白相互作用的蛋白（表1）。

圖2 誘餌載體pGBKT7-NS3的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of bait vector pGBKT7-NS3by double restriction endonuclease digestion

圖3 轉(zhuǎn)化pGBKT7-NS3后Y2HGold酵母中蛋白Western blot結(jié)果Fig.3 Expression of pGBKT7-NS3in Y2HGold yeast cells detected by Western blot

表1 誘餌載體對報告基因的毒性和自激活性檢測Table 1 Toxic effect and self-activation test of bait vector pGBKT7-NS3to the reporter gene

3 討論

NS3蛋白與豬瘟病毒體外致細胞病變有關(guān)［8］，通過對NS3蛋白與細胞病變關(guān)系的研究，將有助于分析豬瘟病毒致病機理和持續(xù)性感染形成機制。

研究表明，NS3蛋白與豬瘟病毒同一個科的C型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）與誘導宿主細胞凋亡有關(guān)。Prikhod Ko等將Vero細胞和HepG2細胞轉(zhuǎn)染表達NS3蛋白的質(zhì)粒48h后，Vero細胞和HepG2細胞均發(fā)生凋亡。并證實NS3蛋白是通過與caspase-8死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合而誘導細胞凋亡的，但NS3蛋白不能與其他帶有DED的凋亡蛋白如FADD結(jié)合。Borowski等認為HCV感染細胞的致病機制可能與NS3蛋白對宿主細胞內(nèi)AMP依賴性信號途徑的影響有關(guān)，因為HCV NS3蛋白中含有一段富含精氨酸的序列，該序列和蛋白激酶A（protein kinase，PKA）的熱穩(wěn)定抑制劑的抑制位點、PKAⅡ型調(diào)節(jié)亞基的自我磷酸化位點以及PKA底物的磷酸受體氨基酸周圍的保守序列極為相似。因此，NS3蛋白在體外能夠抑制蛋白激酶A的活性。Borowski等進一步證實，細胞中HCV NS3蛋白能與蛋白激酶A催化亞基特異性相互作用，從而抑制由AMP依賴性PKA介導的蛋白磷酸化。因此，HCV感染細胞中的NS3可能通過抑制PKA的一系列過程而有助于HCV嚴重影響細胞正常功能。

酵母雙雜交技術(shù)（yeast two-hybrid system）是由Fields和Song在1989年利用釀酒酵母轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4蛋白的特性建立的，可以識別和分析相互作用的蛋白［9］，已經(jīng)用于豬瘟病毒蛋白與宿主細胞蛋白相互作用的研究［10-13］。為篩選與豬瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主蛋白，本試驗構(gòu)建了用于酵母雙雜交篩選的NS3蛋白誘餌載體pGBKT7-NS3，經(jīng)雙酶切，測序和序列比對，證實了目的片段插入正確。篩選與宿主細胞互作蛋白前首先要進行誘餌載體在酵母細胞中的毒性和自激活性檢測。轉(zhuǎn)化誘餌載體pGBKT7-NS3和空載體pGBKT7后的酵母菌在SD/-Trp平板上生長的菌落大小，顏色，克隆數(shù)基本一致，說明誘餌載體pGBKT7-NS3對酵母菌沒有毒性。轉(zhuǎn)化誘餌載體pGBKT7-NS3的酵母細胞在SD/-Trp培養(yǎng)板上為白色菌落，在SD/-Trp/x-α-Gal培養(yǎng)板上為白色菌落，在SD/-Trp/xα-Gal/AbA培養(yǎng)板上無菌落生長，說明構(gòu)建的誘餌載體對報告基因沒有自激活作用。本研究構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-NS3符合篩選酵母雙雜交細胞cDNA文庫的需要，為以后篩選與NS3蛋白相互作用的蛋白研究奠定了基礎(chǔ)。

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