馬建華，魏建忠

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥230000）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）呈世界范圍流行，是一種重要的人獸共患病原菌［1］，根據(jù)豬鏈球菌表面莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）的抗原性，可以將其分為35個血清型（1～34型和1/2型），其中毒力最強、臨床檢出率最高的血清型是豬鏈 球 菌 2 型 （Streptococcus suis serotype 2，SS2）［2-3］。2005年，四川省資陽市暴發(fā)了大規(guī)模的人感染SS2的疫情，病死率極高［4］，引起了高度關(guān)注。國內(nèi)外研究認為豬鏈球菌的致病性與其毒力因子有密切關(guān)系，目前研究較多的豬鏈球菌主要毒力因子有莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（extracellular protein factor，EF）和溶血素（suilysin，SLY）。

1 莢膜多糖

莢膜多糖由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸等5個單糖組成，由于所含單糖種類及連接方式的不同，造成莢膜多糖的成分與結(jié)構(gòu)不同。莢膜多糖的成分和結(jié)構(gòu)與細菌的病原性和血清型有關(guān)，是致病性分離株所必需的組分。莢膜多糖在逃避機體免疫系統(tǒng)，保護細菌不被吞噬中扮演著重要角色。Houde M等［5］研究了SS2的莢膜多糖抗吞噬的分子機制，采用經(jīng)熱滅活的SS2莢膜多糖野生株和莢膜多糖缺失株與巨噬細胞共孵育，分別于1、6、24h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)野生株較缺失株延遲和抑制了感染過程中一氧化氮的產(chǎn)生，表明莢膜多糖對細菌感染期一氧化氮信號通路存在抑制作用，從而破壞了細胞表面的脂質(zhì)微區(qū)，阻止了乳糖苷神經(jīng)酰胺的依賴識別作用，保護細菌抗巨噬細胞吞噬。胡丹等［6］通過對05ZYH33野生株和莢膜多糖缺失株生物學(xué)特性比較發(fā)現(xiàn)，缺失株由于失去表面黏多糖，成鏈能力減弱，失去與SS2莢膜特異抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)的能力，更易被全血清除，但對上皮細胞HEP-2的黏附能力增強，表明莢膜在細菌抵抗吞噬和細菌黏附過程中發(fā)揮重要作用。

2 溶菌酶釋放蛋白和胞外因子

溶菌酶釋放蛋白分子質(zhì)量為136ku，是豬鏈球菌細胞壁上的大分子糖蛋白。Vecht U等［7］對180株自然感染SS2分離株進行研究，發(fā)現(xiàn)在致病性菌株中均含有溶菌酶釋放蛋白和胞外因子蛋白，而在非致病株中卻不含有這2種蛋白，推斷這2種蛋白與SS致病性有緊密關(guān)系，是SS非常重要的毒力因子。曾巧英等［8-9］先后以HEP-2細胞和仔兔脾微血管內(nèi)皮細胞為體外細胞模型，將純化的溶菌酶釋放蛋白溶液和細胞共孵育，光鏡下觀察，溶菌酶釋放蛋白可以誘導(dǎo)HEP-2上皮細胞出現(xiàn)單個細胞或融合成多核巨細胞后凋亡的現(xiàn)象，表明溶菌酶釋放蛋白具有誘導(dǎo)上皮細胞凋亡的功能。微血管內(nèi)皮細胞亦可以和純化的溶菌酶釋放蛋白相互作用發(fā)生形態(tài)學(xué)變化進而凋亡，說明溶菌酶釋放蛋白單獨足以破壞大腦的血管內(nèi)皮細胞屏障。

胞外因子分子質(zhì)量為110ku，是僅能在細菌培養(yǎng)上清液中分離到的胞外蛋白。Fittipaldi N等［10］對100株SS的血清型和標(biāo)記毒力基因的分布進行了研究，結(jié)果顯示最普遍的表型是 MRP＋EFSLY-（40%）和 MRP-EF-SLY＋（35%）。研究表明，不同國家SS2分離株的溶菌酶釋放蛋白和胞外因子的相對分子質(zhì)量有所差異，如美國、澳大利亞、荷蘭、西班牙等國家SS2致病株多數(shù)為大分子質(zhì)量的溶菌酶釋放蛋白和胞外因子，而北美加拿大的SS2致病菌株多為小分子質(zhì)量的溶菌酶釋放蛋白或超大分子質(zhì)量的胞外因子。此外2種毒力因子都具有一定的免疫原性，但溶菌酶釋放蛋白目前僅有截短的原核表達［11］，推測可能是由于溶菌酶釋放蛋白對宿主菌的毒性作用導(dǎo)致其不能完整地正常合成。另有研究證明2種蛋白聯(lián)合起來免疫，對鏈球菌保護力效果更佳［12］。

3 溶血素

溶血素屬依賴膽固醇的細胞溶素家族，是SS生長過程中分泌的一種蛋白。溶血素由sly基因編碼，分為2種類型，即對氧敏感的鏈球菌溶血素O（SLO）和對氧穩(wěn)定的鏈球菌溶血素S（SLS），其分子質(zhì)量分別為54ku和62ku。溶血素通過對機體血小板和淋巴細胞的損傷來破壞機體的凝血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，溶血素陽性的SS可以破壞脈絡(luò)叢上皮細胞，從而突破腦脊液屏障，出現(xiàn)腦膜炎癥狀［13］。Takeuchi D等［14］根據(jù)ST1型和ST104型菌株臨床致病力方面的差異（ST1型和ST104型菌株均能引起敗血癥，但ST1型菌株更易引起腦膜炎的發(fā)生），在溶血素基因轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯水平上進行對比分析，發(fā)現(xiàn)ST104型菌株產(chǎn)生低水平的溶血素。動物攻毒試驗結(jié)果表明，溶血素基因敲除株感染組小鼠存活率顯著增高，野生菌株感染組小鼠死亡前神經(jīng)癥狀明顯，攻毒后72h，2組感染小鼠血液與腦組織細菌分布出現(xiàn)顯著差異。組織病理學(xué)分析顯示，接種野生菌株組的小鼠腦組織血管擴張，出現(xiàn)大量中性粒細胞、單核巨噬細胞；而敲除株感染組的小鼠腦組織未出現(xiàn)明顯出血現(xiàn)象，炎癥細胞也較少，說明溶血素與SS導(dǎo)致的腦膜炎有關(guān)。Seitz M等［15］構(gòu)建了豬鏈球菌CPS-SLY＋株和同源溶血素缺失株，體外溶血及對上皮細胞黏附、入侵試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失株的體外溶血活性消失，CPS-SLY＋株的黏附、入侵作用均比溶血素缺失株顯著增高，結(jié)果表明，溶血素促進了SS對上皮細胞的黏附和入侵作用。此外，對SS的溶血素細胞溶解作用研究中發(fā)現(xiàn)，溶血素介導(dǎo)入侵上皮細胞，造成細胞溶解時，并不需要像CDC家族那樣在細胞膜上打孔來改變細胞通透性從而導(dǎo)致細胞溶解，其分子機制仍需進一步研究。

溶血素同時也是一種良好的免疫保護性抗原［16］。Liu L等［17］在分析SS2菌株05ZYH33全基因組序列的基礎(chǔ)上，克隆表達了溶血素蛋白并對此蛋白進行了免疫保護評價，結(jié)果顯示，溶血素具有明顯免疫保護作用。Du H等［18］構(gòu)建了重組溶血素蛋白（rSLY）和完全缺失溶血活性的點突變蛋白rSLY（P353L），通過動物試驗，對誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及致死性攻擊免疫保護方面做了評估。突變體rSLY與rSLY相比，突變體rSLY在反應(yīng)前期刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生了較低水平的IL-6、KC和IL-10；SS感染小鼠后被動免疫突變體rSLY抗血清，24h內(nèi)未在小鼠體內(nèi)檢測到組織病變，表明突變體rSLY具有很好的免疫保護性。由于能夠抑制SS感染早期引起的炎癥反應(yīng)，突變體rSLY可以作為防治SS中毒性休克的候選疫苗株。

雖然國內(nèi)外公認SS的主要毒力因子是莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、胞外因子和溶血素［19］，但有研究表明，缺失或者敲除這些毒力因子后，菌株仍然具有毒力［20］。因此，新的毒力相關(guān)基因被不斷發(fā)現(xiàn)和鑒定。

4 莢膜唾液酸

唾液酸作為莢膜多糖的單糖成分之一，又稱N-乙酰神經(jīng)氨酸。Lecours M P等［21］證明了唾液酸不是莢膜的主要抗原決定簇。董瑞萍［22］，王長軍［23］等分別對唾液酸合成相關(guān)基因neuB和neuC進行敲除，發(fā)現(xiàn)敲除株莢膜明顯變薄，質(zhì)地更加緊密。小鼠致病試驗中，敲除株毒力顯著減弱。石潔等［24］構(gòu)建了莢膜唾液酸缺失株并進行毒力對比試驗，通過腦組織病理切片分析，在感染野生株的小鼠腦組織中可見顯著的膠質(zhì)細胞增生樣結(jié)節(jié)，同時可見分散出血并伴隨白細胞浸潤，提示野生株能損害血腦屏障引起腦膜炎；體外小鼠全血細胞體系刺激試驗，發(fā)現(xiàn)莢膜唾液酸缺失株刺激后炎性因子MCP-1、IL-6的分泌水平顯著高于野生株組，提示莢膜唾液酸可能在宿主對SS2的識別與應(yīng)答中發(fā)揮抑制作用。試驗還對比了野生菌株和缺失株與宿主細胞的作用，表明莢膜唾液酸缺失后，病原菌對宿主上皮細胞和內(nèi)皮細胞的黏附、入侵作用增強，而在宿主專職免疫細胞內(nèi)的存活能力顯著減弱，以上說明唾液酸對SS的致病性具有重要意義。

5 Cbp40

Cbp40是通過SS2菌株HA9801和T15進行抑制差減雜交試驗證實的SS2的毒力基因［25］，與金黃色葡萄球菌的膠原結(jié)合蛋白Cna有共同的保守結(jié)構(gòu)域。在斑馬魚感染模型中，Cbp40基因敲除株對HEP-2細胞的黏附、生物膜形成的能力及毒力都有所降低。通過基因表達的陣列評估SS2菌株ZY05719、Cbp40基因敲除株與小鼠腦微血管細胞的相互作用，發(fā)現(xiàn)在炎癥和免疫反應(yīng)，白細胞黏附和異嗜細胞黏附方面存在差異。Cbp40作為一種與宿主細胞黏附的細胞外基質(zhì)蛋白，在感染過程中起著重要的作用。

6 VirA

Li P等［20］對野毒株ZY458進行了VirA基因缺失株458Deltavir和功能互補株458Deltavir（pVir）的構(gòu)建，家兔動物試驗結(jié)果顯示，接種野毒菌株ZY458的家兔在感染6d內(nèi)全部死亡，接種功能互補株458Deltavir（pVir）5只家兔中4只于感染6d內(nèi)死亡，而接種VirA基因缺失株458Deltavir組家兔觀察期無任何臨床癥狀出現(xiàn)，體重增加正常，全部存活。此外，通過對野生型毒株和弱毒株的序列分析和對比，發(fā)現(xiàn)VirA基因只存在于強毒株中，因此該基因的功能可能與豬鏈球菌毒力有關(guān)，但其在豬鏈球菌中的致病機理仍不十分清楚。

7 pgdA

Fittipaldi N等［26］鑒定出SS2胞壁肽聚糖脫乙酰作用相關(guān)基因pgdA。體外試驗表明，pgdA基因的缺失并沒有導(dǎo)致SS2對溶菌酶敏感性的增加。pgdA基因缺失株在CD1小鼠和豬的感染模型中都呈現(xiàn)減毒趨勢，毒力損傷主要由于血液中細菌含量減少。細胞試驗中pgdA缺失株很容易被中性粒細胞殺滅，野毒株體外與中性粒細胞共培養(yǎng)過程中pgdA表達水平均上調(diào)，提示肽聚糖脫乙酰作用可能是SS2抵抗機體免疫系統(tǒng)的重要機制。

8 Trag

Trag是采用IVIAT（in vivo induced antigen technology）在SS2豬康復(fù)血清中通量篩選鑒定出的感染相關(guān)因子之一，參與細菌的分泌途徑。Zhang H等［27］發(fā)現(xiàn)Trag基因存在于SS2的毒力菌株中，但不存在于無毒T15菌株中。Trag基因缺失株感染斑馬魚后毒力減弱，推測該基因的功能可能與SS2毒力有關(guān)，但其致病機理有待進一步研究。

9 溶血素相關(guān)基因

一個位于89kb毒力島編碼Ⅲ型溶血素相關(guān)蛋白［28］的基因Hhly3被發(fā)現(xiàn)，對其生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，Hhly3基因缺失株的細胞溶解及溶血活性明顯低于野生菌株。體外全血生長和斑馬魚動物試驗中，缺失株的感染力和毒力均比野生菌株低。試驗表明，除sly外，SS2還能編碼另一種具有溶血活性的溶血素。

10 CiaRH二元調(diào)控系統(tǒng)

CiaRH是二元調(diào)控系統(tǒng)，廣泛存在于細菌中，使生物體在感受并處理環(huán)境刺激時對基因表達做出調(diào)整。Li J等［29］構(gòu)建了CiaRH缺失株，通過體外和體內(nèi)試驗對其毒力進行了測定。與野生株相比，缺失株對上皮細胞和豬髖動脈內(nèi)皮細胞的黏附能力顯著降低，然而巨噬細胞對SS的殺菌活性和體內(nèi)血液對SS的清除力都有所增強。缺失株在CD1小鼠和豬體內(nèi)毒力減弱，發(fā)病率和病死率都明顯降低，試驗結(jié)果表明，CiaRH與SS毒力有關(guān)。

11 分解代謝控制蛋白A

分解代謝控制蛋白A在其他鏈球菌屬中具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用，對SS毒力有顯著影響。Willenborg J等［30］通過構(gòu)建分解代謝控制蛋白A缺失株，得出在富含葡萄糖環(huán)境下分解代謝控制蛋白A是表達CPS所必須的，并推測分解代謝控制蛋白A可能也具有抵御吞噬細胞的殺傷作用。

12 金屬結(jié)合脂蛋白A

金屬結(jié)合脂蛋白A［31］是SS金屬結(jié)合脂蛋白，需在低錳環(huán)境下生長，參與金屬轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的組成，該種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在細菌從宿主體內(nèi)獲取營養(yǎng)的過程中起著至關(guān)重要的作用，其基因缺失株對過氧化氫易感，小鼠感染金屬結(jié)合脂蛋白A基因敲除株顯示為無毒力表型，由此該基因可能與SS的生理生化特性及毒力有關(guān)。

目前SS沒有發(fā)現(xiàn)可區(qū)分強毒株、弱毒株、無毒株的標(biāo)志性毒力因子［32］，國內(nèi)外針對SS毒力因子研究較流行的方法是基因敲除或突變法，由此鑒定出的基因元件可能并不是SS毒力因子，由于參與SS基礎(chǔ)代謝的相關(guān)基因很多，缺失后會影響SS的生長，造成毒力降低或者消失的假象。SS毒力因子的組成十分復(fù)雜，各毒力因子的作用機理及其毒力因子之間的相互作用目前尚不清楚，有待進一步研究。綜上所述，SS的毒力是由多種毒力因子協(xié)同作用的，對毒力因子的深入研究將有助于探究豬鏈球菌的致病機理，建立快速準(zhǔn)確的診斷鑒定方法，對疫苗的研發(fā)也有著重要意義。

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