崔夢楠，田 偉，馬素娟，李明生，馬忠仁，馮玉萍＊

（1.甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；3.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

磁分離技術是以具有超順磁性的磁性微球為固相載體，通過表面功能基團特異性吸附及解吸附，在外加磁場作用下分離目標產(chǎn)物的一種新型分離技術［1］。在磁場條件下，磁性微球能夠穩(wěn)定的懸浮在溶液體系中，其超順磁性能夠快速的使固液分離，而省去傳統(tǒng)分離中離心過濾等繁瑣操作，同時還可以提高分離過程中反應物之間相互作用的動力學速度。另外，磁性微球由于比表面積大，表面可偶聯(lián)的配基容量也大，因而通過共聚、球表面改性后可賦予多種活性功能基團（-COOH、-COH、-NH2等），快速且特異地結合酶、細胞、抗體等生物活性物質［2］。因此，磁分離技術在生物分離純化領域有著廣闊的研究和應用前景。

磁分離技術在生物分離領域中的應用首先由Robinson P J等［3］提出，將纖維素磁性微球用于酶的固定化。隨后的20年，磁性微球在生物分離領域的應用發(fā)展緩慢。進入21世紀后，磁分離技術開始迅速發(fā)展，并在Ugelstad J等［4］研究基礎上相繼開發(fā)了一系列的商品化產(chǎn)品Dynabeads。目前磁分離技術己經(jīng)在細胞分類和分離、蛋白提純、核酸分離、細菌和病毒分離及免疫檢測等諸多方面展現(xiàn)出重要的應用價值。

磁分離技術發(fā)展至今仍然面臨很多問題。磁性微球自身缺陷及分離條件和環(huán)境都對生物大分子物質的分離純化有著至關重要的影響。理想的磁性微球是磁分離技術的基礎，穩(wěn)定的分離環(huán)境是保證磁分離高效進行的必要條件。理想的磁性微球需要具備足夠大的比表面積，表面配基的連接也要均勻，這樣才能夠保證對產(chǎn)物有高效的吸附率。因此，制備適應不同要求的磁性微球已經(jīng)成為研究的熱點。本文從磁性微球結構特點出發(fā)，分析其基本原理，簡單闡述磁性微球在細胞、蛋白質及核酸等分離純化中的現(xiàn)狀，并對其在各部分的應用趨勢進行總結。

1 磁性微球的結構性質和分離原理

1.1 磁性微球的結構和性質

磁性微球是通過適當?shù)睦砘椒▽o機磁性材料和有機高分子材料結合而形成的一種多功能復合材料。根據(jù)球芯和外殼材料的磁性特點可分為磁性核或磁性殼型，混合型和多層型。無機磁性材料主要有金屬 （Fe、Co、Ni）、鐵 氧 體 （MeO·Fe2O3、Fe3O4）、合金（FeCo）、鐵酸鹽等，其中Fe3O4由于磁性能好，制作工藝簡單，成本低，而成為應用最廣泛的磁核。高分子材料有天然與合成兩類。天然高分子材料主要有瓊脂糖、淀粉、明膠、纖維素、殼聚糖等；合成高分子材料主要有聚苯乙烯、聚苯乙烯醇等。

目前磁性微球的制備方法主要有磁性粒子單體聚合法、磁性粒子聚合物組合法和磁性粒子聚合物原位生成法。磁性粒子聚合物組合法制備磁性微球方法簡單，但制備出的磁性微球單分散性差，形貌不規(guī)則。磁性粒子單體聚合法主要是以高分子單體聚合的方法為主，相對磁性粒子聚合物組合法要復雜，制備出的磁性微球分布較寬、粒徑較大或包埋磁性粒子效果差，使得后期應用受到限制［5］。通過不同的制備方法可得到性能不同的磁性微球，再加上表面功能基團的修飾，使得磁性微球幾乎可以偶聯(lián)大部分生物活性物質。應用于生物磁分離技術中的磁性微球應具有合適的磁響應度、均一的粒徑分布、良好的生物相容性、穩(wěn)定的特異吸附表面等特性［6］。

1.2 磁性微球的分離原理

磁分離技術的分離有2種方式，即直接分離法和間接分離法。直接分離法是指磁性微球表面連接的是能夠特異性結合目標產(chǎn)物的基團，在溶液體系中特異性結合目標產(chǎn)物，在磁場作用下與其他物質分離。間接分離法是在分離前先對目標產(chǎn)物進行處理（例如抗原純化中，首先將抗原與第一抗體連接），使其能夠與磁性微球表面的基團（第二抗體）結合，在磁場作用下將攜帶目標產(chǎn)物的復合物分離出來，再借助其他手段解吸附目標產(chǎn)物。

2 磁性微球在細胞分選中的應用

磁性微球在細胞分離中的應用主要分為2類［7］，即非特異性吸附和特異性吸附。磁性微球具有較大的比表面積，并且有較強的極性。正常生理條件下細胞通常也是帶電的。磁性微球和細胞之間可以通過靜電引力結合。這類吸附一般沒有選擇性，所以稱之為非特異性吸附。而特異性吸附則是磁性微球表面偶聯(lián)某種細胞能夠特異性結合的物質，通過特異性吸附分離細胞。這類分離方法更加精確。所以，特異性吸附成為磁性微球在分離細胞中應用的主要方法。

Molday R S等［8］首先提出用磁性微球來分離細胞，用熒光染料標記含羧基的磁性微球，再用碳二亞胺活化，在其表面偶聯(lián)外源凝集素或抗體，成功地分離了B淋巴細胞和人血紅細胞。近年來，Haik Y等［9］采用特異性磁分離技術提取血紅細胞，結果顯示僅有0.85%的血紅細胞殘留，很大程度上提高了人血紅細胞的分離效率。Ting H C等［10］制備了連接抗生物素蛋白的聚苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯微球，特異性吸附了骨髓干細胞表面抗原-1（Sca-1）細胞。Modak N等［11］則將磁分離技術和微流控技術相結合用于細胞分離，為研制磁性微球介導的微流體細胞分離系統(tǒng)提供了重要參數(shù)。還有研究者［12］通過磁分離技術特異性識別微藻類細胞，從而快速從溶液體系中捕獲微藻類植物。另外，磁性分離技術在原核細胞（如細菌細胞）分離中的應用也有報道［13］。

目前，磁性微球在細胞分選中的應用主要是以德國Meltenyi公司研發(fā)的免疫磁性細胞分選技術為標準［14］，其主要成分包括 MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。MACS微珠是偶聯(lián)高度特異性單克隆抗體的超順磁性微球。首先把細胞用MACS微珠特異性標記，然后使這些細胞通過一個放在強而穩(wěn)定磁場中的MACS分選柱，被磁性標記的細胞滯留在柱里，而未被標記的細胞則流出。當分選柱移出磁場后，滯留柱內(nèi)的磁性標記細胞就可以被洗脫出來，這樣就完全可以獲得標記和未標記的2個細胞組分，得到的細胞可立即用于后續(xù)試驗。

Kuana W C等［15］利用帶有特定氨基的磁性單分散聚合微球成功的從人癌細胞系中分離到CD133陽性細胞，其對癌癥的診斷具有重要意義。在癌癥治療過程中，化療前將骨髓抽出，采用細胞磁免疫分離方法，將腫瘤細胞和正常細胞分離，將腫瘤細胞殺死后再將正常細胞注入患者體內(nèi)，在很大程度上減少了病人的痛苦，減少了放射性治療對病人身體的傷害。這在臨床上有相當重要的實際意義。未來幾年這仍將是磁性微球在細胞分選中應用的研究重點之一。

3 磁性微球在核酸分離中的應用

磁性微球在核酸分離中的應用能夠克服傳統(tǒng)核酸分離方法步驟繁瑣、收率低、接觸有毒試劑、實現(xiàn)自動化困難等缺陷，是未來核酸純化技術發(fā)展的一個重要方向。磁性微球在核酸分離中的應用首先由Hawkins T L等［16］于1997年提出，隨后開始快速發(fā)展。有研究者［17］將磁性明膠微球分離提取法和傳統(tǒng)氯仿提取法進行了對比研究，結果發(fā)現(xiàn)磁性微球分離法獲得了大約2倍數(shù)量的DNA，并且DNA質量也優(yōu)于傳統(tǒng)氯仿提取法。大腸埃希菌中核酸的分離也可以借助磁分離技術來實現(xiàn)。Ma C等［18］制備了四氧化三鐵和二氧化硅的單分散復合微球，并將其成功用于大腸埃希菌中核酸的分離。2012年，Percin I等［19］通過乳液聚合法制備聚羥乙基甲基丙烯酸磁性復合納米微球，非特異性分離大腸埃希菌溶菌液中的質粒DNA，結果表明該磁性納米微球使用6次后對質粒DNA仍具有高選擇性，質粒DNA的最終回收率可達92%。另外，王愛迪等［20］將磁性微球提取基因組核酸方法與實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）相結合，成功建立了食品中轉基因成分的快速檢測新方法。

磁性微球在核酸分離中的應用大大提高了核酸的分離效率，同時也為核酸分離的自動化提供了技術支撐?；诖判苑蛛x的全自動核酸分離系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種新型技術。目前，已有不少公司致力于全自動磁分離核酸分離系統(tǒng)的開發(fā)，并取得了較好的進展。其中羅氏公司的最新產(chǎn)品Mag-NA Pure LC 2.0可從各種不同的樣品（如動植物組織、血液、細胞、體液、食品等）中分離純化出高純度的（脫氧）核糖核酸。中國臺灣圓點納米技術開發(fā)有限公司的Smart LabAssist全自動磁珠核酸提取儀基于磁棒架上的磁棒吸附磁珠，將磁珠移至不同的試劑槽內(nèi)，可同時處理32個樣品。科華生物的核酸提取儀采用磁珠法，實現(xiàn)批量化，可同時處理93個樣品，自動化操作，省時省力［21］。

目前，核酸的全自動化提取仍然處在萌芽階段，這是核酸提取技術發(fā)展的必然趨勢，也是磁分離技術在核酸分離領域應用研究的重點方向。在全自動化核酸分離目標實現(xiàn)的過程中需要不斷地去改進究磁性微球自身的特性。

4 磁性微球在蛋白質提純中的應用

磁性微球在生物分離純化中的應用大多都集中在細胞和核酸的分離上。隨著蛋白質組學的快速發(fā)展，磁性微球在蛋白質分離純化中的應用也得到了快速發(fā)展。它是通過在微球表面修飾的功能基團能與靶向蛋白可逆結合，從而達到靶蛋白分離的目的。與傳統(tǒng)分離方法相比有純度高、速度快、回收率高的優(yōu)點。

4.1 磁性微球在蛋白質分離中的應用

磁性微球在蛋白質分離中的應用主要集中于常規(guī)實驗室蛋白分離，如酶蛋白、抗體蛋白、重組蛋白等。Shao M F等［22］制備了由四氧化三鐵/二氧化硅/鎳鋁層狀氫氧化合物組成的三維核殼磁性微球，并將其用于重組蛋白純化中，結果表明微球上的Ni2＋對-His重組蛋白表現(xiàn)出較高的吸附率（239μg/mg）并能持續(xù)幾個純化周期。Li Z H等［23］利用染料配基（活性紅120）偶聯(lián)殼聚糖磁性微球從蛋清溶液中特異性吸附溶菌酶，循環(huán)使用4次后吸附率仍能達到92.6%，最終提取的溶菌酶純度達80.7%，回收率89.1%。Vijaykumar L D 等［24］將氨基苯硼酸磁性微球用于抗體分子的純化，通過磁性微球表面的氨基與抗體偶聯(lián)，每克磁球可結合170mg±10mg并能能洗脫回收160mg±5mg的人IgG；當直接從CHO細胞上清中純化時，98%的IgG可結合，其中95%可有效回收，最終純度達到98%以上。

4.2 磁分離技術和其他技術結合在蛋白質分離中的應用

隨著磁分離技術的發(fā)展，許多研究者將磁分離技術與分子印跡或雙水相萃取相結合應用于蛋白質分離純化中。分子印跡聚合物包裹磁性粒子可形成表面具有分子印跡的磁性材料，通過印跡位點、形狀、官能團的互補作用達到分離蛋白質的目的［25］。該方法操作簡單，選擇性高抗。Tan C J等［26］提出一種共價固定模板蛋白表面印跡法，利用乳液聚合法制備了表面共價結合模板蛋白（牛血清白蛋白）的印跡亞微米磁性粒子，該粒子內(nèi)包納米磁性粒子，有很強的超順磁性，在水溶液中對模板蛋白具有非常好的識別性能。由于模板蛋白固定對蛋白質的成功印跡是十分重要的，因此該方法將有望成為一種普適性蛋白質印跡法。另外，在雙水相體系中，親水性蛋白通常在表面活性劑較少的相中的分配系數(shù)較大，當磁性吸附劑（磁性微球）引入雙水相后，吸附目標蛋白，使其從表面活性劑較少的相進入富含表面活性劑的相，可加速相分離，提高生產(chǎn)能力［27］。Becker J S等［28］將磁性吸附劑和雙水相體系結合，從溶菌酶和卵清蛋白混合體系中純化親水性蛋白溶菌酶，結果顯示溶菌酶最終回收產(chǎn)率達74%，純度超過80%。該方法可用于親水性蛋白的分離。

4.3 磁性微球分離蛋白質的發(fā)展趨勢

磁性微球在蛋白質分離純化領域的應用主要依賴于吸附容量高、選擇性好、可重復使用、價格便宜的磁性微球的制備。因此，應用于蛋白質分離純化領域的理想磁性微球的制備將是未來的發(fā)展趨勢之一。另外，隨著智能高分子材料的快速發(fā)展［25］，將磁性微球與對外界環(huán)境（如溫度、pH、離子強度、光等）敏感的智能高分子材料相結合，合成智能型磁性微粒并將其用于蛋白質的分離純化中也將是未來的發(fā)展方向之一。

5 展望

近年來，磁性微球分離技術用于生物分離純化簡便而備受關注，隨著磁性微球的制備技術逐漸成熟，磁分離技術已經(jīng)由實驗室走向實際應用生產(chǎn)：①磁性微球分離法整體過程緩和，確?；钚猿煞纸Y構完整保留；②分離純化步驟簡單，所有反應可在一個試管中完成；③無需昂貴的大型設備，比如離心機、色譜系統(tǒng)和超濾裝置等；④簡便快速洗脫、產(chǎn)物濃度高；⑤磁分離技術很容易實現(xiàn)分離分析的自動化。此外，目前國外已有相關產(chǎn)品，但是價格昂貴。國內(nèi)在此方面研究仍處于實驗性階段，依然存在諸多問題需改善：①磁性微球制備方法的深入研究，不同的方法從根本上影響著磁性微球在純化過程中性能的穩(wěn)定性；②磁性微球表面修飾的多樣化也決定著純化的效果和速度；③反復利用效果也是磁性微球現(xiàn)存的問題之一。未來，磁性微球分離技術在生物分離純化中很有可能取代現(xiàn)有的純化技術，成為生物純化技術的主要趨勢。

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