邵 遠，姚 璐(綜述)，張有成(審校)

(蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科，蘭州 730030)

魚精蛋白最初發(fā)現(xiàn)于魚類(如蛙魚、鱒魚、鯡魚等)成熟精子細胞,它能將基因DNA集中在精子頭部,促進遺傳信息的傳遞，其是富含陽離子的強堿性蛋白，而且結(jié)合DNA的能力強[1-3]。魚精蛋白截短體(truncated protamine，tP)作為魚精蛋白的衍生物，已經(jīng)被很多研究者用于構(gòu)建融合蛋白。該文就tP在構(gòu)建融合蛋白中的應(yīng)用及探索研究予以闡述。

1 tP的結(jié)構(gòu)及功能

tP是一段長度為15個氨基酸的短肽，保留了富含堿性氨基酸的序列，不僅具有DNA結(jié)合活性，而且具有較小分子量，組織穿透能力強等特點[4]。tP既可以用作DNA的載體，用于構(gòu)建tP/DNA復(fù)合物，也可用于合成融合蛋白。

2 融合蛋白及特點

融合蛋白是將目的基因與靶基因重組形成融合基因，融合基因是在原核生物中表達后的產(chǎn)物。融合蛋白在臨床應(yīng)用廣泛，如DNA疫苗、雙功能酶(多功能酶)、定向藥物、載體，尤其在腫瘤研究方面已經(jīng)取得了一定的成就[5]。然而，一般合成的融合蛋白存在很多不足，最大的缺點是不穩(wěn)定，易發(fā)生降解，而且融合蛋白在體外真核蛋白不易正確折疊，這些缺點都限制了其廣泛的臨床應(yīng)用[6]。

3 tP合成的融合蛋白的臨床前研究

目前臨床中很多研究者已經(jīng)利用tP成功構(gòu)建融合基因，融合基因所表達的融合蛋白克服了普通融合蛋白的不穩(wěn)定性以及不易正確折疊的缺點，為融合蛋白在病毒感染和腫瘤的靶向治療以及其他疾病的治療方面奠定一定的理論基礎(chǔ)。

3.1病毒感染方面的研究 單鏈抗體(single chain variable fragment，ScFv)具有分子小、穿透力強、免疫原性低等特點,已成為診斷和治療的良好導(dǎo)向載體[7-8]。Zhang等[9-10]成功獲得ScFv/tP融合基因，并表達為ScFv/tP融合蛋白。此融合蛋白可以作為PA492基因的載體，將PA492導(dǎo)入犬腎傳代細胞，并可以有效地控制犬腎傳代細胞中的禽流感病毒，而且ScFv/tP融合蛋白作為載體比脂質(zhì)體效果更好。ScFv/tP融合蛋白可以作為禽流感病毒特異小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)的載體，并用于禽流感病毒感染的基因治療，因此ScFv/tP融合蛋白可以為病毒的治療提供一種新的思路。還有學(xué)者將人抗HBsAg ScFv/tP融合基因在大腸埃希菌中表達，純化獲得ScFv/tP融合蛋白，分析其蛋白活性可知其同時具有HBsAg和DNA結(jié)合活性，為ScFv/tP融合蛋白作為載體研究乙型肝炎的治療奠定了理論基礎(chǔ)[11]。

3.2腫瘤靶向治療方面的研究 原癌基因人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)是癌基因erbB2/neu的表達產(chǎn)物,在多種人類腫瘤細胞中高度表達,尤其是乳腺癌，是公認的腫瘤細胞表面的特異性標志分子[12-13]。Kappa light chain constant region(Ck)，即DNA編碼區(qū)的輕鏈恒定區(qū)。王凱等[14]成功構(gòu)建了人抗HER2 ScFv/Ck/tP融合基因，將融合基因克隆入原核表達載體pET32a后，在大腸埃希菌BL21(DE3)LysS中誘導(dǎo)表達，表達的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析及Western blot鑒定表達，再用Ni-NTA(鎳離子親合層析柱)螯合層析介質(zhì)純化。表達的ScFv/Ck/tP融合蛋白同時具有抗原和DNA結(jié)合活性,為ScFv靶向輸送DNA或siRNA用于HER2陽性腫瘤的靶向基因治療提供了依據(jù)。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，是目前發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，具有抑制細胞凋亡，促進細胞轉(zhuǎn)化并且參與細胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生等作用[15]。蔡磊[16]構(gòu)建ScFv/tP融合基因，融合基因在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達，利用HisTrap Ni-NTA螯合層析介質(zhì)純化所得蛋白。研究發(fā)現(xiàn)ScFv/tP融合蛋白可特異性地被肝癌細胞通過內(nèi)吞作用攝入細胞內(nèi)；ScFv/tP融合蛋白同時具有DNA結(jié)合活性。ScFv/tP融合蛋白介導(dǎo)的特異的siRNA能夠靶向誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，理論上ScFv/tP融合蛋白可以作為肝癌靶向治療載體，為肝癌的治療提供了新的方法[16]。上皮細胞黏附分子是一種由GA-733-2基因編碼的相對分子質(zhì)量為40×103的跨膜糖蛋白，作為嗜同種的鈣非依賴性的上皮細胞間黏附分子在上皮癌變過程中發(fā)揮作用。Hao等[17]構(gòu)建了上皮細胞黏附分子單鏈片段可變區(qū)抗體與tP以及siRNA的融合蛋白，此蛋白具有通過結(jié)腸癌細胞識別并結(jié)合上皮細胞黏附分子的抗原活性，而且轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細胞的特異siRNA特異性抑制Wnt信號/β聯(lián)蛋白的信號傳輸，因此EpCAM scFv/tP-siRNA融合蛋白可能為結(jié)腸癌的治療提供新方案。表皮生長因子受體屬Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，是原癌基因C-erbB-1的表達產(chǎn)物，在人體多種實體腫瘤(如結(jié)直腸癌、頭頸部腫瘤、食管癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等)中均有高度表達，與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生長及細胞凋亡的抑制有密切關(guān)系。有學(xué)者成功構(gòu)建了人表皮生長因子受體抗體/tP融合基因,由此融合基因成功表達了ScFv/tP融合蛋白，并通過驗證此融合蛋白具有與表皮生長因子受體抗原和DNA結(jié)合的活性，因而ScFv/tP融合蛋白為表皮生長因子受體表達陽性腫瘤的靶向基因治療奠定了基礎(chǔ)[18]。潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)是由EB病毒編碼的一種蛋白，其與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，LMP1蛋白具有誘導(dǎo)細胞增殖遷移、抑制細胞終末期分化和凋亡等多種信號傳遞和調(diào)控功能[19]。黃秀蘭等[20]成功獲得了LMP1/scFv/tP融合基因，獲得的融合基因片段克隆至原核表達載體pET32a，并在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達融合蛋白，經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠電泳和Western Blot驗證其為LMP1/scFv/tP融合蛋白。LMP1/scFv/tP融合蛋白除了具有特異性結(jié)合LMP1的活性外，還為該融合蛋白用于LMP1相關(guān)腫瘤的基因治療提供了理論依據(jù)。

3.3其他疾病的探索研究 癌鈣調(diào)蛋白是一種鈣結(jié)合蛋白，在機體具有促進軸突再生的作用,并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的作用類似。石燕紅等[21]在原核表達載體中成功構(gòu)建癌鈣調(diào)蛋白/tP融合基因。在大腸埃希菌誘導(dǎo)表達癌鈣調(diào)蛋白/tP融合蛋白，然后通過聚丙烯酰氨凝膠電泳分析及Western blot鑒定表達的蛋白。此融合蛋白理論上可將癌鈣調(diào)蛋白的促進軸突再生的作用與拮抗抑制視神經(jīng)再生的作用結(jié)合起來，用于治療視神經(jīng)的損傷，為視神經(jīng)的損傷后的再生性研究提供了新的思路。

3.4相關(guān)的探索研究 有學(xué)者將抗HIV-1 envelope Fab抗體與魚精蛋白融合重組，成功地與細胞表面受體相結(jié)合，通過細胞內(nèi)吞作用將gag siRNA傳遞入HIV+的T淋巴細胞并有效地阻止了復(fù)制；將抗erbB2 ScFv與魚精蛋白融合重組后成功地將c-myc基因、MDM2(鼠雙微體)基因、血管內(nèi)皮生長因子基因的特異性siRNA導(dǎo)入B16黑色素瘤細胞內(nèi)，并對腫瘤細胞的增殖產(chǎn)生了影響[22]。

4 小 結(jié)

tP構(gòu)建的融合蛋白的方法：研究者設(shè)計引物擴增目的基因，然后在其3′端引入tP的編碼基因,經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴增獲得目的/tP融合基因。再根據(jù)融合基因選擇相應(yīng)的載體，根據(jù)表達載體的限制性酶切位點，在融合蛋白基因的5′和3′末端分別設(shè)計兩種酶切位點，采用聚合酶鏈反應(yīng)為基礎(chǔ)的基因拼接獲得目的基因/tP融合基因。將融合基因亞克隆至另一個克隆載體中，經(jīng)過酶切鑒定和測序驗證；進一步將序列完全正確的融合蛋白基因克隆至原核表達的載體。最后在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達目的基因/tP的融合蛋白。再通過聚丙烯酰氨凝膠電泳分析及Western blot鑒定表達的融合蛋白，融合蛋白不僅保持了與抗原的結(jié)合活性，而且具有抗原與DNA結(jié)合的能力。此方法已經(jīng)被多位研究者應(yīng)用于實驗研究，但目前仍處于臨床前研究階段，因此很多臨床研究及探索研究都是很有必要的。

tP構(gòu)建的融合蛋白已經(jīng)應(yīng)用于病毒和腫瘤的臨床前研究，而且tP在構(gòu)建融合蛋白中起重要作用，為融合蛋白廣泛的臨床研究及臨床應(yīng)用提供了可能。今后的研究中，通過探索一些病毒和腫瘤特異的抑制或治療基因，并將其與tP基因融合，然后在原核生物中表達出融合蛋白，探索該融合蛋白對病毒或腫瘤的治療作用，可以為病毒或腫瘤治療提供新思路以及研發(fā)新藥物。

[1] Poplonska K,Wojtczak A,Kwiatkowska M,etal.Cytochemical and immunocytochemical studies of the localization of histones and protamine-type proteins in spermatids of Chara vulgaris and Chara tomentosa[J].Folia Histochem Cytobiol,2007,45(4):367-374.

[2] Ortner A,Wernig K,Kaisler R,etal.VPAC receptor mediated tumor cell targeting by protamine based nanoparticles[J].J Drug Target,2010,18(6):457-467.

[3] Awe S,Renkawitz-Pohl R.Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone-to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster[J].Syst Biol Reprod Med,2010,56(1):44-61.

[4] Wen WH,Liu JY,Qin WJ,etal.Targeted inhibition of HBV gene expression by single-chain antibody mediated small interfering RNA delivery[J].Hepatology,2007,46(1):84-94.

[5] 馬海智.融合蛋白在腫瘤研究中的應(yīng)用[J].腫瘤防治研究,2007,34(5):383-386.

[6] 李立家,肖庚富.基因工程[M].北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社，2004：53-61.

[7] Aires da SilVa F，Costa MJ，Corte-Real S，etal.Cell type-specific targeting with sindbis pseudotyped lentiviral vectors displaying anti-CCR5 single-chain antibodies[J].Hum Gene Ther，2005,16(2):223-234.

[8] Suzuki M，Takayanagi A，Shimizu N.Targeted gene delivery using humanized single-chain antibody with negatively charged oligo peptide tail[J].Cancer Sci，2004,95(5):424-429.

[9] Zhang T,Wang CY,Zhang W,etal.Generation and characterization of a fusion protein of single-chain fragment variable antibody against hemagglutinin antigen of avian influenza virus and truncated protamine[J].Vaccine，2010,28(23):3949-3955.

[10] Zhang T,Zhao PS,Zhang W,etal.Antisense oligonucleotide inhibits avian influenza virus H5N1 replication by single chain antibody delivery system[J].Vaccine，2011,29(8):1558-1564.

[11] 孟艷玲,溫偉紅,薛茜，等.人抗HBsAg單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白基因的構(gòu)建、表達及活性鑒定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006,27(15):1349-1352.

[12] Kumar R,Yarmand-Bagheri R.The role of HER2 in angiogenesis[J].Semin Oncol，2001,28(5 Suppl 16):27-32.

[13] Baxevanis CN，Sotiropoulou PA，Sotiriadou NN，etal.Immunobiology of HER-2/neu oncoprotein and its potential application in cancer immunotherapy[J].Cancer Immunol Immunother，2004,53(3):166-175.

[14] 王凱,溫偉紅,王濤，等.人源抗HER2單鏈抗體/輕鏈恒定區(qū)/魚精蛋白截短體融合蛋白的基因構(gòu)建、表達及活性鑒定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2007,28(7):581-584.

[15] Guha M,Xia F,Raskett CM,etal.Caspase 2-mediated tumor suppression involves survivin gene silencing[J].Oncogene，2010,29(9):1280-1292.

[16] 蔡磊.攜帶Survivin 特異性siRNA 的完全人源性肝癌單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白對肝癌凋亡的影響研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2010.

[17] Hao H,Zhen Y,Wang Z,etal.A novel therapeutic drug for colon cancer:EpCAM scFv-truncated protamine (tp)-siRNA[J].Cell Biol Int,2013,37(8):860-864.

[18] 張峰,王小英,唐奇,等.人源抗EGFR抗體-魚精蛋白融合蛋白的制備及活性分析[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,31(5):651-654.

[19] Rmeier U,Hofmann R,Kilger E,etal.Latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus coordinately regulates proliferation with control of apoptosis[J].Oncogene,2005,24(10):1711-1717.

[20] 黃秀蘭,唐旭東,熊亮,等.重組抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白的基因構(gòu)建及表達[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,26(1):1-4.

[21] 石燕紅，薛錚，朱彤,等.癌鈣調(diào)蛋白/魚精蛋白截短體融合基因在原核表達載體中的構(gòu)建及鑒定[J].眼科研究，2010，28(5):401-405.

[22] Song E,Zhu P,Lee SK,etal.Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors[J].Nat Biotechnol,2005,23(6):709-717.