翟碩莉

摘 要： 菌落總數(shù)的測(cè)定是食品衛(wèi)生檢驗(yàn)的一個(gè)重要指標(biāo)，本文綜述了菌落總數(shù)測(cè)定常用的方法：國(guó)標(biāo)法、阻抗法、ATP生物發(fā)光技術(shù)、濾膜法、流式細(xì)胞技術(shù)等，簡(jiǎn)要展望了該領(lǐng)域未來(lái)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞： 菌落總數(shù) 檢測(cè)技術(shù) 食品

菌落指的是生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上，通常由一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而成的肉眼可見(jiàn)的微生物細(xì)胞群體。菌落總數(shù)作為食品安全的重要衛(wèi)生指標(biāo)，反映食品被污染的程度。食品生產(chǎn)、運(yùn)輸、消費(fèi)過(guò)程中的微生物污染造成的食源性疾病是世界安全中最突出的問(wèn)題。GB/T4789.2中規(guī)定的菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過(guò)處理后，在一定條件下培養(yǎng)（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等），所得1 mL（或1g）檢樣中形成的菌落總數(shù)。該規(guī)定中的“一定時(shí)間”通常指48h～72h培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌落，這一時(shí)間段只有細(xì)菌能夠長(zhǎng)成菌落，菌落總數(shù)即活的細(xì)菌數(shù)，且不包括嗜冷菌、嗜熱菌、厭氧菌等特殊環(huán)境條件下生長(zhǎng)的菌。目前，檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對(duì)食品中菌落總數(shù)的測(cè)定通常選擇國(guó)標(biāo)法，但因國(guó)標(biāo)法的檢測(cè)周期較長(zhǎng)，影響產(chǎn)品的新鮮度和貨架期，快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生且發(fā)展迅速。

1.國(guó)標(biāo)法

GB/T4789.2規(guī)定菌落總數(shù)的測(cè)定方法有兩種：平板菌落計(jì)數(shù)法和菌落總數(shù)PetrifilmTM測(cè)試片法。平板菌落計(jì)數(shù)法包括采樣、稀釋、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)等步驟，過(guò)程繁雜，需要一定的專(zhuān)業(yè)操作技能。平皿長(zhǎng)出的菌落有的比較小，有的顏色與培養(yǎng)基相近或相同，在計(jì)數(shù)過(guò)程中不容易區(qū)別，因此在實(shí)際工作中常常將TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）加入到培養(yǎng)基中。TTC是脂溶性的光敏感復(fù)合物，能被活細(xì)胞還原為紅色，使培養(yǎng)基中的菌落呈紅色，便于計(jì)數(shù)。

菌落總數(shù)PetrifilmTM測(cè)試片法是將菌液滴至含培養(yǎng)基和指示劑的紙片上進(jìn)行培養(yǎng)，紙片由滅菌濾紙、纖維膜、膠膜等作為載體，省略了培養(yǎng)基配制、消毒滅菌等過(guò)程。近年來(lái)的研究報(bào)道稱美國(guó)3M公司生產(chǎn)的PetrifilmTM效果好。

2.阻抗法

阻抗法是利用菌體代謝過(guò)程中能將培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)等電惰性物質(zhì)分解為小分子的胺類(lèi)、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)鹽等有電活性的物質(zhì)，在溶液兩端通以小振幅交流電，通過(guò)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)阻抗參數(shù)值的變化，快速、定量分析樣品中的微生物變化情況，阻抗值與微生物污染程度存在相關(guān)關(guān)系，樣品中微生物污染程度高，則阻抗參數(shù)變化較大，建立阻抗值與菌落總數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)定食品的阻抗值，計(jì)算出食品中含有的菌落總數(shù)。阻抗法比傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法更快速，能夠動(dòng)態(tài)地對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高。其缺點(diǎn)是投資高，對(duì)好鹽微生物難以檢測(cè)。

3.ATP生物發(fā)光技術(shù)

ATP生物發(fā)光測(cè)定法是一種快速檢測(cè)菌落總數(shù)的方法，是基于螢火蟲(chóng)發(fā)光機(jī)理設(shè)計(jì)的。活菌中含有ATP且其含量固定，菌體死亡后，ATP將很快被菌體中的酶分解，研究表明，ATP生物發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度與ATP含量呈正比，ATP生物發(fā)光法是通過(guò)提取菌體的ATP，測(cè)定ATP濃度，從而推算出樣品中的活菌數(shù)。反應(yīng)機(jī)理：以熒光素、ATP、氧氣為底物，在蟲(chóng)熒光素酶的催化下，熒光素分子被激活，其電子躍遷到不穩(wěn)定的高能態(tài)，當(dāng)電子回到低能態(tài)時(shí)發(fā)出熒光光子，熒光素不斷被激活，連續(xù)產(chǎn)生熒光。ATP生物發(fā)光法的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高，其檢測(cè)過(guò)程僅需要數(shù)分鐘，其缺點(diǎn)是不能區(qū)分非菌體ATP，會(huì)干擾結(jié)果。另外，ATP的提取方法也會(huì)造成干擾和抑制發(fā)光作用。

4.濾膜法

濾膜法又稱膜過(guò)濾法，原理：待檢檢樣通過(guò)已滅菌的濾膜，經(jīng)過(guò)抽濾，菌體被留在濾膜上，然后將膜貼于選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)長(zhǎng)出的菌落數(shù)即可推算出檢樣中的微生物數(shù)量。此方法投資小，但僅適用于液體或氣體，且含微生物數(shù)量較小的樣品，不適用于含有直徑大于濾膜孔徑的顆粒狀樣品。濾膜法通常用于飲料或水中菌落總數(shù)的測(cè)定，若用于固體或直徑大于濾膜孔徑的顆粒狀樣品，則需用無(wú)菌水浸提樣品，取上清液通過(guò)濾膜過(guò)濾。

5.流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞技術(shù)以流式細(xì)胞儀為工具，其檢測(cè)原理是樣品經(jīng)試劑處理時(shí)，只對(duì)樣品中存在的活菌進(jìn)行熒光標(biāo)記。這些試劑基于一種非熒光底物，這種底物在酶的作用下可與活細(xì)胞結(jié)合，生成熒光標(biāo)記細(xì)胞，并進(jìn)行富集。標(biāo)記后的微生物細(xì)胞被注射進(jìn)ALS儀器內(nèi)的一條石英流式細(xì)胞柱，形成一條狹窄的分析流，確保微生物單個(gè)接連通過(guò)激光激發(fā)柱，激活激發(fā)熒光標(biāo)記細(xì)胞發(fā)出熒光，每個(gè)細(xì)胞形成的熒光信號(hào)由靈敏的檢測(cè)器收集并由數(shù)字處理器分析，得出樣品中的菌數(shù)。對(duì)食品中的活菌數(shù)直接進(jìn)行檢測(cè)，速度快，無(wú)需增菌，可在90～100 min內(nèi)出具檢測(cè)結(jié)果，靈敏度高。

食品衛(wèi)生與人類(lèi)健康關(guān)系密切，菌落總數(shù)的檢測(cè)是食品衛(wèi)生程度的重要指標(biāo)。隨著微生物檢測(cè)技術(shù)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，產(chǎn)生了很多關(guān)于菌落總數(shù)測(cè)定的新方法、新技術(shù)、新儀器，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法目前仍是菌落總數(shù)測(cè)定的主要方法。除上述列舉的方法外，還有定量PCR法、顯微圖像識(shí)別技術(shù)、放射測(cè)量法、固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法等，各種方法都有優(yōu)勢(shì)，但在研究過(guò)程中也暴露出一些不足，是科研人員努力的方向。