吳又多，付友思，齊高相，陳麗杰，白鳳武，2

（1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024；2 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

能源是推動(dòng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵，隨著傳統(tǒng)石油資源的逐漸枯竭以及原油價(jià)格的不斷上漲，探索新型可再生能源已成為當(dāng)前生物質(zhì)能源領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-3]，丁醇作為新一代可再生生物燃料極具發(fā)展?jié)摿4-6]。傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵工藝主要以糧食作物玉米或糖蜜作為原料，生產(chǎn)成本超過(guò)總成本的60%，較低的經(jīng)濟(jì)適用性及丁醇產(chǎn)量嚴(yán)重制約了其工業(yè)發(fā)展[7-8]，亟待來(lái)源更為豐富且更為廉價(jià)的非糧生物質(zhì)原料，并優(yōu)化發(fā)酵條件[9-13]，以期建立經(jīng)濟(jì)型生物丁醇發(fā)酵制造工藝[1，7，14-15]。

果聚糖作為自然界中含量較為豐富的碳水化合物資源之一，廣泛存在于菊芋、菊苣、大麗花等植物中。其中，菊芋是近年來(lái)廣為利用的一種廉價(jià)非糧生物質(zhì)物料，富含果糖資源且具有較高的生物質(zhì)產(chǎn)量[16-17]，具有明顯的作物抗逆特性，其塊莖水解液中葡萄糖與果糖成分比例接近1∶4。事實(shí)上，果糖基物料用于丁醇發(fā)酵的研究報(bào)道相對(duì)較少，Marchal等[18]利用 Clostridium acetobutylicum IFP904發(fā)酵經(jīng)菊粉酶水解過(guò)的菊粉，丙酮和丁醇的總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到 23～24g/L。陳麗杰等[19]利用 C.acetobutylicum L7發(fā)酵菊芋水解液，丁醇濃度達(dá)到了11.21g/L。這主要是因?yàn)樵谝云咸烟羌肮腔旌象w系為底物模擬菊芋物料進(jìn)行的丁醇發(fā)酵中，存在著果糖利用率較低及丁醇代謝合成能力不足等關(guān)鍵問(wèn)題[20]。本文對(duì)基于果糖與葡萄糖不同混合比例的丁醇發(fā)酵性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明二者混合比例能夠影響果糖利用能力，為探究葡萄糖與果糖的代謝利用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為果糖基物料的高效生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丁醇提供重要的理論參考及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

所使用菌株系本實(shí)驗(yàn)室馴化保存的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌C.acetobutulicum L7。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基[21]（g/L）：葡萄糖 20， 胰蛋白胨30， 酵母粉 10。

種子培養(yǎng)基（g/L）：混合糖（果糖與葡萄糖）55，乙酸銨 2.76，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，酵母粉2。

發(fā)酵培養(yǎng)基[22]（g/L）：混合糖（果糖與葡萄糖）55，乙酸銨 2.76，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，酵母粉2。

葡萄糖及果糖混合比例依次由1∶2、2∶3、3∶2提高至3∶1，上述培養(yǎng)基接種前均在121℃蒸汽滅菌15min。

1.2.2 培養(yǎng)方法

菌種活化培養(yǎng)：活化培養(yǎng)基預(yù)先置于厭氧操作箱（Thermo Scientific，F(xiàn)orma Anaerobic System）過(guò)夜除氧，將冷凍保藏的菌種溫育后以 5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）接種量接種于20m L活化培養(yǎng)基中，自然初始pH值，37.5℃厭氧培養(yǎng)18～20h。

種子擴(kuò)大培養(yǎng)：種子培養(yǎng)基預(yù)先置于厭氧操作箱過(guò)夜除氧，將充分活化的菌種以10%）接種量接種于100m L種子培養(yǎng)基中，自然初始pH值，37.5℃厭氧培養(yǎng)18～20h。

發(fā)酵培養(yǎng)：預(yù)先向發(fā)酵罐（1.5BG-4-3000，Shanghai Baoxing Engineering，China）通入無(wú)菌高純N2至15min，以保證其厭氧發(fā)酵體系，將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種以10%接種量接種于1.1L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37.5℃，150r/min，初始pH值5.5條件下進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.3 分析方法

生物量測(cè)定，取200μL發(fā)酵液，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在 620nm 處吸光度（OD620），菌體濃度= 0.8009×OD620g/L；葡萄糖濃度采用葡萄糖分析儀（Biosensor SBA-50，Institute of Biology，Shandong Academy of Sciences，Shandong，China）進(jìn)行定量測(cè)定，總還原糖濃度測(cè)定采用DNS法[23]進(jìn)行測(cè)定，果糖濃度即為總還原糖濃度與葡萄糖濃度之差；發(fā)酵液中丙酮、乙醇及丁醇組分濃度采用氣相色譜（Agilent 6890A GC）進(jìn)行定量測(cè)定，色譜分離條件：毛細(xì)管色譜柱Agilent HP-INNOWAX （30m×0.25mm×0.50μm），柱溫100℃，進(jìn)樣口溫度250℃，F(xiàn)ID 檢測(cè)器溫度300℃，H2流速40m L/min，空氣流速400m L/min，載氣N2流速 30m L/m in，進(jìn)樣量0.2μL，分流比 50∶1，內(nèi)標(biāo)物為異丁醇。發(fā)酵液中乙酸和丁酸組分濃度采用高效液相色譜（Waters 1525 HPLC）進(jìn)行定量測(cè)定，色譜分離條件：有機(jī)酸分析柱 Aminex HPX-87H （300mm×7.8mm；Bio-Rad，Hercules），流動(dòng)相0.005 mol/L H2SO4，流速0.5m L/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫50℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm，示差折光檢測(cè)器溫度 50℃。色譜柱：Am inex HPX-87H 有機(jī)酸分析柱（300 mm×7.8mm，Bio-Rad，Hercules），流動(dòng)相0.005mol/L H2SO4，流速0.5m L/m in，進(jìn)樣量20μL，柱溫50℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，二極管矩陣檢測(cè)器溫度50℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 果糖與葡萄糖不同混合比例下的丁醇發(fā)酵

前期研究工作分別以55g/L不同底物（葡萄糖、果糖、混合糖及菊芋水解液）進(jìn)行了批次丁醇發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如表1所示。以單一葡萄糖為底物的丁醇發(fā)酵周期最短，丁醇產(chǎn)量最高達(dá)到了11.2g/L，丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)率分別為0.255g/(L·h)與0.427g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了0.204g/g與0.342g/g，而以單一果糖為底物的丁醇發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)124h，發(fā)酵效率相對(duì)較低，丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)率分別為 0.083g/(L·h)與0.133g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率分別為0.188g/g與0.300g/g，表明丙酮丁醇梭菌對(duì)果糖代謝速率較低，但發(fā)酵終點(diǎn)丁醇產(chǎn)量仍可達(dá)到10.3g/L。然而在以混合糖（葡萄糖∶果糖=1∶4）模擬菊芋物料為底物的丁醇發(fā)酵中，盡管發(fā)酵周期縮短至 76h，但終點(diǎn)果糖殘余濃度高達(dá) 23.3g/L，丁醇與總?cè)軇┊a(chǎn)量?jī)H為 5.5g/L及9.0g/L，糖轉(zhuǎn)化率及溶劑產(chǎn)率極低，且發(fā)酵過(guò)程中菌體代謝利用果糖能力不足，嚴(yán)重制約了發(fā)酵效率，而這一結(jié)果同以菊芋水解液為底物的丁醇發(fā)酵結(jié)果極其相似。因此探究果糖與葡萄糖二者混合比例對(duì)丁醇發(fā)酵性能的影響，有效降低發(fā)酵終點(diǎn)殘?zhí)菨舛?，提高果糖利用率，為菊芋?shí)際物料的高效利用具有非常重要的科研及現(xiàn)實(shí)意義。

2.1.1 葡萄糖與果糖混合比例為1∶2的丁醇發(fā)酵

當(dāng)葡萄糖與果糖混合比例為 1∶2時(shí)，如圖1所示，發(fā)酵周期為 68h，相對(duì)于混合糖模擬菊芋物料發(fā)酵過(guò)程縮短了8h，發(fā)酵終點(diǎn)丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到了 9.7g/L與 16.0g/L，分別提高了 76.4%與 77.8%，終點(diǎn)殘?zhí)菨舛葍H為 2.1g/L，有機(jī)酸濃度為5.6g/L且在發(fā)酵中后期無(wú)明顯重吸收過(guò)程。發(fā)酵至24h葡萄糖消耗殆盡，而果糖發(fā)酵至12h開(kāi)始進(jìn)行代謝利用，前期葡萄糖阻遏效應(yīng)較為明顯，而伴隨著葡萄糖進(jìn)一步消耗，果糖可被緩慢協(xié)同利用。菌體達(dá)到最大濃度OD620為2.4，隨后菌體濃度OD620開(kāi)始出現(xiàn)短暫下降。發(fā)酵28～44h果糖代謝與溶劑代謝近乎停滯，而發(fā)酵至56h左右，菌體細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的二次生長(zhǎng)狀態(tài)，表明菌體代謝活性得到恢復(fù)，此后果糖得到迅速利用，相應(yīng)的菌體濃度OD620再次回升至2.4，與此同時(shí)，丁醇等主要溶劑開(kāi)始迅速積累。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)提高葡萄糖/果糖比例能夠保證發(fā)酵后期菌體細(xì)胞的代謝活性，進(jìn)而有利于對(duì)果糖的代謝利用，有效降低發(fā)酵終點(diǎn)果糖濃度，丁醇等溶劑代謝合成得以順利進(jìn)行。

2.1.2 葡萄糖與果糖混合比例為2∶3的丁醇發(fā)酵

圖1 葡萄糖與果糖混合比例為1∶2的丁醇發(fā)酵

表1 不同發(fā)酵底物條件下的丙酮丁醇發(fā)酵結(jié)果

當(dāng)葡萄糖與果糖混合比例提高至2∶3時(shí)，發(fā)酵至28h時(shí)葡萄糖消耗殆盡，而發(fā)酵至16h時(shí)果糖代謝利用開(kāi)始緩慢進(jìn)行，此時(shí)菌體濃度最大OD620提高至3.5，發(fā)酵周期縮短至52h，丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量有所下降，分別為 8.0g/L與 12.4g/L，此外，發(fā)酵終點(diǎn)有機(jī)酸濃度較高，見(jiàn)圖2。值得注意的是，發(fā)酵至32h左右時(shí)進(jìn)入了短暫的二次生長(zhǎng)狀態(tài)，但果糖代謝利用活性依然較低，發(fā)酵終點(diǎn)果糖濃度高達(dá)14.7g/L。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，進(jìn)一步提高葡萄糖/果糖比例至2∶3后，菌體細(xì)胞活性雖然有所恢復(fù)，但對(duì)果糖的代謝利用能力仍顯不足。

圖2 葡萄糖與果糖混合比例為2∶3的丁醇發(fā)酵

2.1.3 葡萄糖與果糖混合比例為3∶2的丁醇發(fā)酵

當(dāng)?shù)孜锾侵衅咸烟潜壤M(jìn)一步提高，發(fā)酵周期再次縮短至48h，至24h葡萄糖消耗殆盡，而果糖代謝依然從發(fā)酵至16h開(kāi)始，此前同樣出現(xiàn)了明顯的葡萄糖阻遏效應(yīng)。在此過(guò)程中菌體達(dá)到最大OD620為4.2，隨后快速下降直至發(fā)酵終點(diǎn)，發(fā)酵后期過(guò)程中并未出現(xiàn)二次生長(zhǎng)狀態(tài)。最終丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達(dá)到 9.0g/L及 15.0g/L，殘?zhí)菨舛认陆抵?7.9g/L，但果糖利用率有所降低，見(jiàn)圖3。此外有機(jī)酸濃度降至2.9g/L，而發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量亦有所下降，說(shuō)明進(jìn)一步提高葡萄糖/果糖比例至3∶2一定程度上緩解了有機(jī)酸積累現(xiàn)象，但對(duì)于發(fā)酵中后期果糖的代謝利用活性并沒(méi)有有效提高。

2.1.4 葡萄糖與果糖混合比例為3∶1的丁醇發(fā)酵

圖3 葡萄糖與果糖混合比例為3∶2的丁醇發(fā)酵

圖4 葡萄糖與果糖混合比例為3∶1的丁醇發(fā)酵

當(dāng)葡萄糖與果糖混合比例最終提高至3∶1時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。發(fā)酵時(shí)間為48h，此時(shí)葡萄糖基本消耗殆盡，發(fā)酵至 28h，菌體濃度達(dá)到最大 OD620為4.3，已接近以單一葡萄糖為底物的發(fā)酵水平。發(fā)酵終點(diǎn)丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量分別達(dá)到 9.2g/L及15.5g/L，有機(jī)酸濃度降至2.3g/L，果糖殘余濃度為8.6g/L，果糖利用率下降。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖/果糖比例進(jìn)一步提高至3∶1時(shí)，菌體細(xì)胞主要以葡萄糖為發(fā)酵底物，且發(fā)酵后期并未出現(xiàn)利用果糖的二次生長(zhǎng)狀態(tài)，相反發(fā)酵全程果糖代謝利用極其緩慢，葡萄糖阻遏效應(yīng)明顯，最終導(dǎo)致菌體細(xì)胞代謝果糖生產(chǎn)丁醇能力不足。

2.2 葡萄糖與果糖不同混合比例對(duì)果糖利用效率及丁醇產(chǎn)量的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，菊芋水解液中葡萄糖與果糖組成比例接近1∶4，且在分別以菊芋水解液及葡萄糖/果糖混合糖模擬物料為底物的批次丁醇發(fā)酵過(guò)程中，存在發(fā)酵提前終止，果糖利用率較低，丁醇等溶劑產(chǎn)量較低等技術(shù)問(wèn)題。研究工作隨后改變混合糖模擬體系中葡萄糖與果糖比例探究其對(duì)丁醇發(fā)酵性能的影響，結(jié)果如表2所示，隨著葡萄糖與果糖混合比例的提高，雖然細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖代謝利用及溶劑代謝合成能力明顯增強(qiáng)，但是果糖利用效率并沒(méi)有相應(yīng)隨之不斷提高。其中，當(dāng)葡萄糖/果糖混合比例為1∶2時(shí)，果糖利用率最佳，終點(diǎn)果糖利用效率高達(dá)95.0%，這一結(jié)果與該條件下發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)的二次生長(zhǎng)狀態(tài)相一致，表明果糖能量代謝相對(duì)活躍，這對(duì)后續(xù)溶劑代謝合成的順利進(jìn)行至關(guān)重要。與此同時(shí)，而隨著葡萄糖/果糖混合比例的繼續(xù)提高直至3∶1時(shí)，發(fā)酵性能已接近以葡萄糖為底物的丁醇發(fā)酵，盡管丁醇等溶劑合成速率提升，但果糖利用率反而明顯下降，此時(shí)發(fā)酵過(guò)程中溶劑代謝主要來(lái)源于底物葡萄糖。這些結(jié)果表明，適當(dāng)提高葡萄糖/果糖混合比例將有利于菌體細(xì)胞對(duì)果糖的代謝利用。

事實(shí)上，依賴(lài)于磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）是嚴(yán)格厭氧菌和兼性厭氧菌吸收糖類(lèi)的主要機(jī)制，C.acetobutylicum中的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)與Clostridium pasteurianum、 Bacillus subtilis及Escherichia coli中PTS系統(tǒng)相似[24]，糖類(lèi)在被轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的同時(shí)也要經(jīng)過(guò)磷酸化[25-27]，葡萄糖、果糖等六碳糖必須通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的磷酸化進(jìn)入菌體內(nèi)[28]。另一方面，Hutkins等[29]在C.acetobutylicum中發(fā)現(xiàn)，菌體轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖和果糖的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)不同，它們的區(qū)別就在于催化葡萄糖磷酸化的酶為葡萄糖激酶，而催化果糖轉(zhuǎn)運(yùn)并磷酸化為果糖-6-P的酶為特異性的果糖激酶[30]。在本研究中，在不同葡萄糖/果糖混合比例下，批次丁醇發(fā)酵前期葡萄糖對(duì)果糖利用主要表現(xiàn)出一定的阻遏效應(yīng)，但是在葡萄糖消耗殆盡前仍有較短的協(xié)同利用階段。在此前提下，發(fā)酵后期果糖代謝利用能力具有明顯差異性，如在葡萄糖/果糖比例為1∶2條件下，菌體細(xì)胞出現(xiàn)典型的二次生長(zhǎng)狀態(tài)，在葡萄糖消耗殆盡后菌體細(xì)胞對(duì)果糖代謝利用能力得到增強(qiáng)，最終提高了果糖利用效率，但是相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不明確。

3 結(jié) 論

表2 葡萄糖與果糖不同混合比例對(duì)丁醇發(fā)酵性能的影響

以混合糖模擬菊芋物料為底物的丁醇發(fā)酵存在果糖利用效率及丁醇產(chǎn)量較低等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了發(fā)酵效率。對(duì)于C.acetobutylicum來(lái)說(shuō)，雖然葡萄糖與果糖均利用均依賴(lài)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）進(jìn)行，但是二者仍有不同，且在細(xì)胞內(nèi)吸收代謝速率具有較大差異，在本實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)不同葡萄糖/果糖比例的丁醇發(fā)酵，發(fā)酵前期葡萄糖表現(xiàn)一定的阻遏效應(yīng)，盡管二者一定程度上亦能同步利用，直至葡萄糖消耗殆盡前，果糖代謝利用相對(duì)緩慢。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)提高葡萄糖與果糖的混合比例，有效地縮短了發(fā)酵周期，由76h縮短至48h，同時(shí)菌體最大生物量大幅度提高，OD620由2.1提高至4.3。值得注意的是，當(dāng)葡萄糖與果糖比例為1∶2時(shí)，后期果糖利用階段菌體細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的二次生長(zhǎng)狀態(tài)，能量代謝活性相對(duì)增強(qiáng)，對(duì)于后續(xù)果糖代謝利用及溶劑合成具有重要促進(jìn)作用，在保證果糖利用的同時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)殘?zhí)怯行Ы档停〈嫉热軇┐x得到順利進(jìn)行。最終果糖利用效率達(dá)到95.03%，而丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量也分別達(dá)到了9.7g/L與16.0g/L，有效地提高了丁醇發(fā)酵效率。相反，當(dāng)進(jìn)一步提高葡萄糖/果糖比例時(shí)，葡萄糖消耗殆盡后，果糖代謝利用能力依舊不足，發(fā)酵終點(diǎn)果糖殘?zhí)菨舛容^高，丁醇等溶劑產(chǎn)量有所下降。以上研究結(jié)果為探究葡萄糖及果糖代謝利用機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為菊芋物料或混合糖模擬物料發(fā)酵生產(chǎn)丁醇奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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