陳瑋 陳亞萍 楊恭

1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)系，上海 200240；2.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實驗室，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)系，上海 200240；3.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

宮頸及宮頸癌間質(zhì)成纖維細胞的分離、鑒定與衰老檢測研究

陳瑋1 陳亞萍1 楊恭2,3

1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)系，上海 200240；2.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實驗室，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)系，上海 200240；3.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

背景與目的：宮頸癌作為最常見的婦科惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病呈年輕化趨勢。目前認(rèn)為人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染，特別是高危型HPV感染是其發(fā)生的主要因素。已有研究證實，在腫瘤發(fā)生的微環(huán)境中，間質(zhì)成纖維細胞衰老可能促進上皮性腫瘤的發(fā)生，但宮頸癌的發(fā)生是否也伴有間質(zhì)成纖維細胞的衰老鮮見報道。本研究擬對正常宮頸和宮頸癌間質(zhì)成纖維細胞進行特異性研究，以揭示慢性炎癥誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的機制，旨在為宮頸癌的診治提供新的理論依據(jù)。方法：分離純化正常宮頸成纖維細胞(normal fi broblasts，NFs)和宮頸癌相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fi broblasts，CAFs)，通過ELISA法檢測細胞因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的分泌水平；并用衰老相關(guān)β-半乳糖甘酶染色(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal)、細胞計數(shù)和蛋白質(zhì)印記法(Western blot)分別鑒定細胞衰老、繪制細胞生長曲線和檢測NFs與CAFs中p16蛋白表達。結(jié)果：CAFs分泌的細胞因子IL-6和VEGF比NFs高2倍以上(P＜0.05)；CAFs中SA-β-gal的活性比NFs高；而CAFs中p16水平的表達水平比NFs中高。結(jié)論：間質(zhì)成纖維細胞衰老可能與宮頸癌的發(fā)生和HPV密切相關(guān)，研究細胞因子介導(dǎo)的宮頸癌間質(zhì)衰老可能有助于宮頸癌的預(yù)防、診斷和治療。

宮頸癌；間質(zhì)成纖維細胞；細胞衰老；上皮腫瘤細胞

宮頸癌作為婦科最常見的惡性腫瘤之一，已成為危害全球女性生命健康的主要殺手，近年來發(fā)病呈低齡化的趨勢。宮頸癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素的發(fā)展過程，人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的感染，特別是高危型HPV感染是其發(fā)生的重要因素，其中宮頸鱗癌大部分為HPV16感染，宮頸腺癌最常見的是HPV18感染，但只有一部分感染高危型HPV的女性會發(fā)展為宮頸癌，提示存在其他協(xié)同因素［1-2］。已有研究證明，正常的間質(zhì)成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)對于維持上皮細胞的穩(wěn)態(tài)有重要作用，而癌相關(guān)間質(zhì)成纖維細胞(cancer-associated fi broblasts，CAFs)能夠誘導(dǎo)和促進上皮細胞發(fā)生瘤樣轉(zhuǎn)變［3］。宮頸感染會導(dǎo)致一個慢性炎性反應(yīng)，宮頸內(nèi)膜與宮頸上皮的微小潰瘍，增加上皮的修復(fù)和增殖，一些研究已證實，細胞因子水平和端粒酶活性提高與宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變級別的提高和浸潤性宮頸癌相關(guān)［4-5］。而慢性炎性反應(yīng)是多種上皮性腫瘤的重要高危因素［6-7］。炎性反應(yīng)細胞產(chǎn)生的細胞因子、趨化因子等構(gòu)成的炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)了間質(zhì)細胞的衰老和上皮腫瘤的發(fā)生，此外，衰老的間質(zhì)細胞釋放的促炎性反應(yīng)遞質(zhì)又通過旁分泌的方式作用于鄰近的上皮細胞從而促進腫瘤上皮細胞生長［7-9］。但是宮頸癌中間質(zhì)成纖維細胞是否衰老，其特性如何目前鮮見報道。本研究分離和建立了相應(yīng)的正常和癌相關(guān)成纖維細胞系，探討其與宮頸癌和HPV的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 細胞、組織及患者標(biāo)本

選擇復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科2012年3月收治的患者7例，所有患者均為初治患者，術(shù)前均未接受任何治療。CAFs獲取源(宮頸癌Ⅰb1期行廣泛子宮切除術(shù)加盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)患者標(biāo)本1例和宮頸癌ⅠA1期行全子宮切除術(shù)患者標(biāo)本2例)。NFs獲取源(卵巢癌行全子宮加雙側(cè)附件切除術(shù)患者標(biāo)本4例)。標(biāo)本獲取前均與患者簽署知情同意書，獲得本人許可。取生長速度接近的CAFs和NFs各兩組進行細胞培養(yǎng)。

1.2 試劑

MCDB培養(yǎng)液和M199培養(yǎng)液以1∶1比例混合，同時加入20%的胎牛血清(購自美國Gibco公司)，20 ng/mL上皮細胞生長因子(epidermal growth factor， EGF)和1%的青霉素及鏈霉素。2.5%胰酶購自美國Gibco公司。MTT粉購自美國Sigma公司。雙抗購自法國Biowest公司。GENMED細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測試劑盒購自上海杰美醫(yī)藥科技有限公司。p16抗體購自美國Sigma-Aldrich公司(1∶2 000稀釋)。Vimentin(1∶2 000稀釋)和pancytokaratin(1∶2 000稀釋)用Santa cruz的抗體測定。β-actin抗體購自美國Sigma-Aldrich公司(A5441，1∶20 000稀釋)。ELISA試劑盒購自美國Peprotech公司。

1.3 宮頸和宮頸癌成纖維細胞的分離純化與培養(yǎng)

無菌手術(shù)刀片切取標(biāo)本組織即刻送至原代細胞培養(yǎng)室(整個過程控制在15 min內(nèi))，然后進行下列無菌操作：將組織塊移至新的培養(yǎng)皿中，10%雙抗的PBS清洗3次，用無菌手術(shù)刀片溫和地刮下宮頸表面細胞，直至整個組織塊不能再刮為宜(0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm)，然后將細胞置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37 ℃溫箱中，3 d后更換新鮮培養(yǎng)基，5～6 d可見到明顯的貼壁細胞，之后每隔48 h觀察1次細胞同時更換新鮮培養(yǎng)基。正常情況下，14 d后可見細胞貼滿6 cm培養(yǎng)皿。在細胞生長密度達到80%～90%時進行細胞傳代。由于上皮細胞與間質(zhì)成纖維細胞混合生長，本實驗使用了2種方法分離純化獲得純化的宮頸成纖維細胞［10］。①細胞時間差酶消化法：將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基吸走，PBS沖洗2次，加入胰酶使其流過所有細胞表面，顯微鏡下持續(xù)觀察，大約60 s，成纖維細胞脫離培養(yǎng)皿底部而上皮細胞仍然貼壁，此時立即加入2 mL培養(yǎng)基中和，然后加入適量培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復(fù)上述操作1次。下次傳代時同上，經(jīng)過幾次處理，就可將上皮細胞和成纖維細胞分開，再經(jīng)過2～3次傳代即可得到純化的宮頸成纖維細胞。②細胞反復(fù)貼壁法：成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞能在短時間內(nèi)(大約20～30 min)完成附著過程(但不一定完全伸展)，而上皮細胞(大部分)在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，利用此差別可以純化細胞。具體步驟如下：將細胞懸液接種在1個培養(yǎng)瓶內(nèi)靜置30 min。在顯微鏡下觀察，見部分細胞貼壁，稍加搖動也不浮起時，將細胞懸液吸入另1個培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)20 min，然后重復(fù)上述操作，在第1瓶和第2瓶以成纖維細胞為主，往后幾瓶即上皮細胞為主，下次傳代時同上便可最終得到純化的宮頸NFs。顯微鏡下觀察培養(yǎng)的宮頸NFs和CAFs的形態(tài)學(xué)特征。

1.4 細胞中HPV16 E6的鑒定

細胞或組織中的總RNA用TRIzol試劑提取，并測定其濃度，所有樣品均用5 μg RNA，用SuperScript First Round Synthesis System(Invitrogen, Carlsbad，CA)試劑盒合成互補DNA(cDNA)。最后用50 ng DNA進行半定量PCR。GAPDH基因上游引物：5’-GAGAACGGGAAGCTTGTCATC-3’；下游引物：5’-CCACGACGTACTCAGCGCCAG-3’；擴增產(chǎn)物103 bp。HPV 16 E6 基因上游引物：5’-GAATGTGTGTACTGCAAGC-3’；下游引物：5’-TGGATTCCCATCTCTATAT-3’；擴增產(chǎn)物：93 bp。反應(yīng)條件為ABI自動程序95 ℃10 min 1個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min 40個循環(huán)。結(jié)果用溴乙錠染色，1%瓊脂糖凝膠觀察HPV 16 E6的擴增。

1.5 宮頸癌組織和正常宮頸組織的HE染色以及間質(zhì)細胞和上皮細胞鑒定

石蠟固定的宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織，經(jīng)常規(guī)切片后進行伊紅-蘇木素(HE)染色。

1.6 ELISA檢測

將CAFs或NFs培養(yǎng)48 h，待細胞生長密度達85%，收集新鮮培養(yǎng)基或-80 ℃保存，根據(jù)美國R&D System公司的ELISA試劑盒說明書進行細胞因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的檢測。

銀隆召開第一屆董事會第八次會議，決定免去孫國華的董事長及總裁職務(wù)，由盧春泉出任公司董事長，賴信華出任公司總裁。

1.7 衰老相關(guān)β-半乳糖甘酶染色(SA-β-gal)法檢測

將細胞接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，隔天待細胞密度達到50%～60%時按文獻［11］的方法進行操作：用PBS將細胞洗2次，然后用2%甲醛與0.2%戊二醛混合液在室溫下固定細胞(3～5 min)，用PBS洗滌后，加入衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色液含1 mg x-gal，40 mmol/L緩沖液(pH為6.0)，5 mmol/L亞鐵氰化鉀(potassium ferrocyanide)，5 mmol/L鐵氰化鉀(potassium ferricyanide)，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl，避光37 ℃染色2～16 h。CAFs的半乳糖苷酶活性較高(藍色細胞較多)，而NFs呈現(xiàn)的活性(藍色細胞)較少。最后在顯微鏡下拍照。

1.8 成纖維細胞的Western blot檢測

隨著對宮頸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機制的深入研究發(fā)現(xiàn)，VEGF和抑癌基因p16發(fā)揮至關(guān)重要的作用。取出生長密度達到80%的細胞，去除培養(yǎng)基，PBS清洗3次，刮取細胞移入Eppendorf管中，加入細胞裂解液，放置冰上溫育30 min，14 000×g離心5 min，取上清液。用Western blot檢測NFs和CAFs中VEGF和p16蛋白水平的表達。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計細胞衰老比率，用Student t檢驗分析差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

波形蛋白(vimentin)和總角蛋白(pancytokaratin)分別是成纖維細胞和上皮細胞特有的細胞標(biāo)志物。Western blot檢測結(jié)果表明，總角蛋白只在上皮細胞中表達，而波形蛋白主要在成纖維細胞中表達。在宮頸癌和正常宮頸上皮組織中有部分波形蛋白的表達是正?，F(xiàn)象，因為在組織分離過程中混有少量成纖維細胞(圖1A)。隨后，我們對組織和成纖維細胞進行了HPV16 E6基因擴增的鑒定，發(fā)現(xiàn)只有宮頸鱗癌組織中有HPV16的感染，而在CAFs、正常宮頸上皮組織和NFs中均未發(fā)現(xiàn)HPV 16的感染，而宮頸癌中HPV 16感染的結(jié)果也與臨床檢測的結(jié)果相一致(圖1B)。最后我們對原始分離組織進行了HE染色，發(fā)現(xiàn)宮頸癌和正常宮頸組織中均有上皮細胞和成纖維細胞的存在(圖1C)。

2.2 衰老相關(guān)β-半乳糖甘酶染色

我們成功地分離并建立了兩株正常成纖維細胞系(NF3和NF7)和兩株宮頸癌相關(guān)成纖維細胞系(CAF11和CAF15)，首先在不同傳代時間測定了細胞衰老的主要標(biāo)志物SA-β-gal，發(fā)現(xiàn)CAFs中藍染的衰老細胞(38%)比NFs中的藍染的細胞數(shù)量(7%)多而且染色強度高(P＜0.05)，說明同代CAFs的細胞衰老程度大于NFs(圖2A)。接著，我們又繪制了兩株正常成纖維細胞系和兩株宮頸癌相關(guān)成纖維細胞系生長曲線圖，發(fā)現(xiàn)宮頸正常的成纖維細胞生長速度明顯快于宮頸癌相關(guān)成纖維細胞生長速度(圖2B、C)。

圖1 間質(zhì)細胞的分離和HPV感染的檢測Fig. 1 Identi fi cation of stromal cells and examination of HPV infection

2.3 衰老相關(guān)蛋白標(biāo)志物檢測

我們用Western blot同時測定了VEGF的細胞內(nèi)表達水平，發(fā)現(xiàn)CAFs中的表達確實比NFs中高，這項結(jié)果也驗證了上述用ELISA測定的細胞培養(yǎng)基分泌水平。此外由于p16是公認(rèn)的細胞衰老標(biāo)志物，因此我們用p16的抗體也測定了NFs和CAFs中的p16表達水平，發(fā)現(xiàn)CAFs中p16蛋白表達比NFs中p16蛋白表達明顯增強(圖3)。

2.4 細胞因子IL-6、VEGF分泌

VEGF是促進腫瘤血管生成的主要因子之一，細胞衰老過程中是否伴隨VEGF的升高尚無明確報道，而IL-6是重要的促腫瘤生長的細胞因子，因此我們用ELISA法同時測定了VEGF和IL-6在細胞培養(yǎng)基中的分泌水平。通過收集生長密度達到85%的兩株CAFs和兩株NFs的培養(yǎng)基，用ELISA試劑盒進行IL-6和VEGF的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組CAFs中IL-6和VEGF水平均明顯高于NFs中的IL-6和VEGF水平，說明CAFs分泌的細胞因子IL-6和VEGF的量比NFs分泌的細胞因子IL-6和VEGF多(圖4)。

圖2 正常宮頸NFs和宮頸CAFs傳代培養(yǎng)及生長曲線Fig. 2 Normal fi broblasts (NFs) and cancer-associated fi broblasts (CAFs) cultured fi gures and growth curves

圖3 ELISA法測定VEGF和IL-6在2株正常成纖維細胞系(NF3和NF7)和2株宮頸癌相關(guān)成纖維細胞系(CAF11和CAF15)培養(yǎng)基中的分泌水平Fig. 3 Secretive expression of IL-6 and VEGF in NFs and CAFs detected by ELISA error bars represent the standard deviation of data collected from triplicate tests

圖4 Western blot檢測結(jié)果顯示CAFs中p16和VEGF蛋白表達比NFs中p16和VEGF蛋白表達明顯增強Fig. 4 Western blot showed that the expression of VEGF and p16 was higher in CAFs than in NFs

3 討 論

宮頸癌作為婦科最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌，位居第二。宮頸癌的發(fā)生是宮頸上皮內(nèi)瘤變-早期癌-浸潤癌的一個由量變到質(zhì)變的過程，完成這一過程大約需要8～10年。其發(fā)生和轉(zhuǎn)移與癌細胞所處的內(nèi)外環(huán)境密切相關(guān)。早期的腫瘤研究大多將研究重點放在腫瘤細胞本身，關(guān)注腫瘤細胞的突變、增殖、凋亡、信號通路改變等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中其他非腫瘤細胞或者間質(zhì)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展同樣起著非常重要的作用。與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的成纖維細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、細胞因子及其受體正在受到越來越多的關(guān)注與研究。

本研究分離和建立了正常宮頸和宮頸癌間質(zhì)成纖維細胞，通過ELISA法檢測炎性細胞因子IL-6、VEGF的分泌情況、SA-β-gal了解細胞衰老程度、細胞計數(shù)繪制細胞生長曲線、Western blot檢測p16蛋白表達情況，并比較了CAFs分泌的IL-6和VEGF與NFs分泌的IL-6和VEGF；CAFs中SA-β-gal的活性與NFs中SA-βgal的活性；以及 CAFs中p16蛋白的表達水平與NFs中p16蛋白的表達水平差異，從而推斷，間質(zhì)成纖維細胞衰老可能與宮頸癌的發(fā)生和HPV是密切相關(guān)的。

目前，對于腫瘤微環(huán)境的研究還處于起步階段。已有研究表明，間質(zhì)細胞的衰老可以促進鄰近上皮細胞腫瘤的形成，從而為上皮腫瘤的研究提供新的理論。多種上皮腫瘤組織中均有癌相關(guān)成纖維細胞，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均有重要的促進或介導(dǎo)腫瘤的放、化療抵抗作用［12-14］。有研究發(fā)現(xiàn)，促炎性反應(yīng)細胞因子IL-6在調(diào)節(jié)細胞衰老和腫瘤發(fā)生方面起著重要作用，現(xiàn)在普遍認(rèn)為促炎性反應(yīng)遞質(zhì)和基質(zhì)成分也促進腫瘤的發(fā)展，因為其可以刺激細胞生長，抑制凋亡，使胞外基質(zhì)有利于腫瘤細胞生長［15］。IL-6具有炎性反應(yīng)分子的雙重作用，能抑制細胞生長(誘導(dǎo)衰老)和促進細胞生長(促進腫瘤)［16］。VEGF已被確認(rèn)是迄今為止腫瘤組織中最重要的促進血管生成的血管生長因子，其通過受體在促進血管生成的同時提高血管通透性，直接影響腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移［17-18］，而p16可以通過誘導(dǎo)細胞衰老而抑制血管生長和VEGF的表達［19-20］。腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移是一個由多因素參與的非常復(fù)雜的過程。而腫瘤轉(zhuǎn)移和炎性反應(yīng)細胞浸潤有著相似的形成過程，均涉及到細胞黏附和跨內(nèi)皮遷移等，趨化因子及其受體在炎性反應(yīng)細胞活化、遷移和準(zhǔn)確定位中發(fā)揮著重要的作用，而這一過程中還有許多的疑問，比如腫瘤間質(zhì)中是否存在有消退間質(zhì)成纖維細胞衰老的細胞因子及這種消退是否可以降低上皮腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移？炎性反應(yīng)和腫瘤都是多因素控制的復(fù)雜病理過程，如果能揭示慢性炎性反應(yīng)如何導(dǎo)致腫瘤，將對宮頸癌的新藥研制帶來新的方向。

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Isolation, identification, and senescence examination of cervical cancer and normal cervical fibroblasts

CHEN Wei1, CHEN Ya-ping1, YANG Gong2,3(1.Department of Gynecology and Obstetrics, the 5thPeople’s Hospital Af fi liated to Fudan University; Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200240; 2.Central Laboratory, the 5thPeople’s Hospital Affi liated to Fudan University; Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200240; 3.Cancer Research Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Center; Depatment of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

YANG Gong E-mail: yanggong@fudan.edu.cn

Background and purpose:Cervial cancer is most common gynecological malignancy. In recent years, the number of the young patients has obviously risen. It is now believed that almost all cases of cervical cancer are caused by exposure to a high-risk human papilloma virus (HPV). It has demonstrated that epithelial cancer can induce the senescence of normal stromal fi broblasts and senescent fi broblasts can promote tumor growth. This study by comparing the secretion of interleukin-6(IL-6) and vascular endothelial growth factor(VEGF) helped us to understand the mechanism of cervical cancer, and providesd more adequate theoretical and experimental basis for clinical early diagnosis and treatment of the disease. This study characterized normal fi broblasts (NFs) and cancer-associated fi broblasts (CAFs) to understand the mechanism how the chronic inflammation induced cervical cancer, and to provide noveltheoretical basis for clinical diagnosis and treatment of the disease.Methods:NFs and CAFs were isolated and puri fi ed from normal and cervical cancer tissues. The expression levels of IL-6 and VEGF in cell culture medium were measured by ELISA and cellular senescence was detected by senescence-associated beta galactosidase (SA-β-gal) staining. The senescent marker p16 was analyzed by Western blot.Results:Our data showed that the expressions of both IL-6 and VEGF were higher in CAFs than in NFs (P＜0.05), and that the blue staining of SA-β-gal and the expression of p16 and VEGF were stronger in CAFs than in NFs.Conclusion:Cervical epithelial cancer may be resulted from the senescence of stromal fi broblasts and HPV infection. Studying on cytokine-mediated stromal senescence may have a potential value for prevention, diagnosis, and treatment of cervical cancer.

Cervical cancer; Stromal fi broblast; Cellular senescence; Epithelial cancer cell

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.04.004

R73-34

A

1007-3639(2014)04-0258-08

2013-08-12

2014-01-23）

國家自然科學(xué)基金面上項目(No: 91129721)。

楊恭 E-mail:yanggong@fudan.edu.cn