李明 連海峰 劉成霞 胡營濱 李有杰

1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濱州 256603；2.濱州醫(yī)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)重點實驗室，山東 煙臺 264003

miR-486-5p對胃癌細胞株SGC7901生物學(xué)行為的影響

李明1* 連海峰1 劉成霞1 胡營濱1 李有杰2

1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濱州 256603；2.濱州醫(yī)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)重點實驗室，山東 煙臺 264003

背景與目的：既往研究表明微小RNA-486-5p(miR-486-5p)在多種腫瘤的進展中起重要作用，但其在胃癌中作用的研究較少，本研究旨在探討miR-486-5p對胃癌細胞株SGC7901增殖、凋亡及遷移能力的影響。方法：使用實時定量PCR(quantification real-time PCR，qRT-PCR)檢測胃癌細胞株SGC7901及胃黏膜上皮細胞GES-1中miR-486-5p的表達，構(gòu)建miR-486-5p過表達質(zhì)粒，使用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染胃癌細胞株SGC7901，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞后miR-486-5p的表達豐度，噻唑藍(MTT)法及流式細胞儀檢測細胞的增殖及凋亡情況，Transwell小室遷移實驗檢測細胞的遷移能力。結(jié)果：miR-486-5p在SGC7901細胞中表達明顯下調(diào)，SGC7901細胞轉(zhuǎn)染miR-486-5p過表達質(zhì)粒后，miR-486-5p表達明顯上調(diào)，細胞增殖、遷移能力降低，凋亡率增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：miR-486-5p可抑制胃癌細胞株SGC7901的增殖和遷移。

胃癌；微小RNA-486-5p；增殖；凋亡；遷移

胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率在我國惡性腫瘤中均居首位，世界范圍內(nèi)胃癌是第二位致患者死亡的惡性腫瘤。盡管近年來胃癌的診斷和治療取得了較大的進步，但患者的總體治療效果和預(yù)后仍不理想，尤其是進展期的胃癌患者。胃癌的發(fā)生是一個多基因參與、多步驟完成的復(fù)雜生物學(xué)過程，對胃癌發(fā)病的具體病因及確切的發(fā)病機制目前尚不清楚，因此從不同的分子水平探求胃癌發(fā)生的機制對于制定新的治療策略具有重要的臨床意義［1］。

微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來備受關(guān)注的內(nèi)源性非編碼RNA，長約21～25 nt，廣泛存在于真核細胞中，進化上具有高度保守性，表達水平具有組織特異性和時相性。在人體內(nèi)，miRNA可與mRNA 3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)互補結(jié)合，當(dāng)miRNA和靶mRNA完全配對時誘導(dǎo)mRNA降解，不完全配對時則抑制靶基因的翻譯。一條miRNA可調(diào)控多個靶基因，而一個mRNA可同時接受數(shù)個miRNA的調(diào)控，故miRNA可在細胞內(nèi)形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，參與細胞增殖、分化、凋亡及免疫防御等生理功能的調(diào)節(jié)，影響生命整個生命過程。研究表明miRNA基因多位于易發(fā)生斷裂、缺失、移位的染色體脆性位點，因而miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，miRNA有望成為腫瘤治療的新分子靶點［2-3］。

微小R-486-5p(miR-486-5p)是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，Navon等［4］使用微陣列方法證實miR-486-5p在胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌的表達均下調(diào)。Wang等［5］研究發(fā)現(xiàn)miR-486-5p在肺癌組織中表達下調(diào)，體外實驗證實miR-486-5p通過作用于ARHGAP5發(fā)揮抑癌作用。Mees等［6］發(fā)現(xiàn)has-miR-486-5p和胰腺導(dǎo)管腺癌的進展密切相關(guān)。目前關(guān)于miR-486-5p在胃癌中的研究較少，本研究首先檢測胃癌細胞株和胃黏膜上皮細胞中miR-486-5p的表達，然后使用脂質(zhì)體法將miR-486-5p過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胃癌細胞株SGC7901，上調(diào)SGC7901細胞內(nèi)miR-486-5p的表達，探討miR-486-5p對SGC7901細胞增殖、凋亡及遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞及質(zhì)粒

胃癌細胞株SGC7901購于武漢博士德公司，胃黏膜上皮細胞GES-1由重慶醫(yī)科大學(xué)王璐璐博士惠贈；miR-486-5p過表達質(zhì)粒(GV214-miR)由上海吉凱公司構(gòu)建、合成。合成miR-486-5p前體序列并在兩端設(shè)計BamHⅠ/ HindⅢ酶切位點，插入GV214多克隆位點，同時構(gòu)建陰性質(zhì)粒(GV214-NC，表1) 。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自Hyclone公司，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量 PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，熒光實時定量PCR引物由廣州銳博有限公司設(shè)計合成，MTT購自Promega公司，Transwell小室購自Corning公司，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

SGC7901細胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d用0.25%的胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)期細胞用于實驗。

表1 miRNA-486-5p序列及相關(guān)NC的序列Tab. 1 The miRNA-486-5p sequence and related NC sequence

1.4 實時定量PCR(quantification real-time PCR，qRT-PCR)檢測GES-1、SGC7901細胞中miR-486-5p的表達

收集處于對數(shù)生長期的兩種細胞，按以下步驟操作：①按照TRIzol試劑說明提取總RNA，1%的瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外可見分光光度計檢測RNA的純度和濃度；②按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)條件如下：70 ℃ 10 min、冰育2 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 10 min；③qRT-PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：95 ℃20 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 5 s，40個循環(huán)，每個樣品做3個平行管，每次實驗至少重復(fù)3次；④數(shù)據(jù)分析 miR-486-5p相對表達水平用2-ΔΔCT方法計算(CT值是目標(biāo)擴增產(chǎn)物打到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，內(nèi)參為U6基因。

1.5 miR-486-5p過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901細胞

取對數(shù)生長期細胞1×106個接種于6孔板，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞密度70%后，將細胞分為3組：單純RPMI-1640培養(yǎng)組、GV214-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、GV214-miR過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，將培養(yǎng)基換成無血清、無雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基(每孔1 mL)，質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000分別用100 μL PRMI 1640培養(yǎng)基稀釋后，以質(zhì)粒(μg)∶脂質(zhì)體(μL)=1∶2的比例混勻后靜置30 min，逐滴加入并輕晃混勻，培養(yǎng)6 h后換為含完全培養(yǎng)基，48 h后收集細胞進行下一步分析。

1.6 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞miR-486-5p豐度

轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞各組細胞，其他步驟同1.4。

1.7 噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期細胞，每孔1×104接種于96空板，共分3組：空白對照組、GV214-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和GV214-miR過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)至細胞密度70%左右，后兩組分別轉(zhuǎn)染，方法同上，與24、48及72 h分別呈色一塊板。呈色反應(yīng)：吸取舊的培養(yǎng)基，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，微量震蕩器上震蕩10 min，使結(jié)晶溶解，選擇490 nm波長在酶標(biāo)儀上測量各孔吸光度(A)值，然后以時間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖，顯示各組細胞增殖曲線。

1.8 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

細胞分組及轉(zhuǎn)染同前，于轉(zhuǎn)染48 h后每組收集細胞1×105個，按Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒分別說明書處理各組細胞，30 min內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.9 Transwell小室遷移實驗

轉(zhuǎn)染48 h后，用不含血清的培養(yǎng)基制備各組單細胞懸液，將細胞密度調(diào)整為2.5×105個/mL，取400 μL加入Transwell上室中，在下室即24孔板內(nèi)加入600 μL含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室，濕棉簽擦去上室細胞，PBS緩沖液洗3次后，用-20 ℃預(yù)冷的甲醇固定細胞10 min，然后吸盡甲醇，PBS洗3次后自然風(fēng)干，于0.01%結(jié)晶紫染色30 min，風(fēng)干后用手術(shù)刀片沿壓痕將小室膜輕輕切下于光鏡下觀察，并隨機選取上、下、左、右及中間5個視野，計數(shù)穿膜細胞，并求平均值，以穿膜細胞的數(shù)目代表SGC7901細胞的體外遷移能力。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-486-5p在SGC7901、GES-1細胞中的表達

miR-486-5p及U6擴增曲線均為典型S型曲線，溶解曲線呈單峰且溶解溫度均一，表明引物特異性好，qRT-PCR結(jié)果可靠。分析結(jié)果顯示，與GES-1細胞(1.06±0.19)相比，miR-486-5p在SGC7901細胞中的表達量為0.48±0.12，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 GES-1和SGC7901細胞miR-486-5p 相對表達量Fig. 1 The relative expression of miR-486-5p of GES-1 and SGC7901 cells

2.2 GV214-miR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞miR-486-5p豐度明顯上調(diào)

與未轉(zhuǎn)染組miR-486-5P表達量(1.02±0.11)相比，GV214-miR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中miR-486-5p相對表達量為8.45±0.42(P＜0.05)，GV214-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中miR-486-5p相對表達量為1.09±0.07(P＞0.05)。結(jié)果提示SGC7901細胞轉(zhuǎn)染GV214-miR質(zhì)?？娠@著提高miR-486-5p的表達，證實其可以作為研究miR-486-5p功能的有效指標(biāo)(圖2)。

2.3 miR-486-5p對細胞增殖能力的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組相比，GV214-m i R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力明顯降低(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染GV214-NC質(zhì)粒組則無明顯變化(P＞0.05，圖3)。

圖2 各組細胞miR-486-5p 相對表達量Fig. 2 The relative expression of miR-486-5p of SGC7901 cells in various groups

圖3 MTT法檢測各組SGC7901細胞增殖狀態(tài)Fig. 3 MTT assays showed the cell proliferation abilities of SGC7901 cells in various groups

2.4 miR-486-5p對細胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，GV214-miR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率［(15.4±2.1)%］明顯高于空白對照組［(4.2±1.1)%］和GV214-NC［(5.3±1.2)%］質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)，而空白對照組和GV214-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖4)。

圖4 各組SGC7901細胞凋亡率Fig. 4 Apoptosis rates of SGC7901 cells in various groups

2.5 miR-486-5p過表達質(zhì)粒對SGC7901細胞體外遷移能力的影響

與空白對照組SGC7901細胞的穿膜細胞數(shù)(108.6±9.3)及GV214-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(105.2±9.8)相比，GV214-miR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(45.2±8.6)明顯降低(P＜0.05)，而空白對照組及GV214-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，但其穿膜細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖5)。

圖5 各組SGC7901細胞體外遷移能力Fig. 5 In vitro migration abilities of SGC7901 cells in various groups

3 討 論

miRNA與腫瘤的關(guān)系是目前腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點之一，大量研究表明腫瘤組織和正常組織中miRNA表達譜存在明顯差異，這些差異表達的miRNA通過調(diào)節(jié)下游靶基因的表達參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等病理過程。對于已發(fā)現(xiàn)的在腫瘤中異常表達的miRNA，其研究重點的是預(yù)測作用靶點及闡明其作用機制。目前研究者對miRNA的研究還停留在實驗室階段，人工構(gòu)建的pre-miRNA轉(zhuǎn)染細胞以糾正低表達的miRNA及反義抑制劑抑制上調(diào)的miRNA是目前研究的熱點，為腫瘤的基因治療提供了新的切入點，有望在腫瘤的基因治療方面取得重大突破［7］。

近年來miRNA在胃癌中的研究逐漸受到關(guān)注，其獨特的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式為胃癌的研究提供了新的方向和思路。在胃癌中，越來越多的異常表達的miRNA被發(fā)現(xiàn)，其中部分miRNA的作用靶點及機制得到初步闡明。例如Wada等［8］使用基因芯片技術(shù)分析了多個胃癌細胞系的miRNA及人胚腎細胞HEK-293T的miRNA表達譜，并結(jié)合實時定量PCR證實miR-212在多個胃癌細胞系內(nèi)表達下調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-212通過直接作用MECP2(methyl-CpG-binding protein)參與胃癌的發(fā)生過程。Xu等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-335在胃癌組織及細胞內(nèi)均表達下調(diào)，使用miR-335可抑制過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細胞株SGC7901增殖及遷移侵襲，熒光報告基因?qū)嶒炞C實miR-335通過直接作用于Bcl-w及特異性蛋白1(specificity protein 1，SP1)發(fā)揮抑癌作用。

既往研究表明，miR-486-5p與多個腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Oh等［10］報道m(xù)iR-486-5p在胃癌中可抑制OLFM4的表達，從而發(fā)揮抑癌作用。目前關(guān)于miR-486-5p在胃癌中的研究較少，我們首先使用qRT-PCR證實胃癌細胞株SGC7901中miR-486-5p表達明顯下調(diào)，為進一步確定miR-486-5p在胃癌中的作用，本研究使用miR-486-5p過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901細胞，轉(zhuǎn)染后其表達明顯上調(diào)。MTT和Transwell小室遷移實驗證實，miRNA-486-5p能抑制SGC7901細胞的增殖和遷移，流式細胞術(shù)證實miRNA-486-5p可促進細胞凋亡。綜上所述，miR-486-5p在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

本研究結(jié)果證實，miR-486-5p在胃癌細胞株中表達明顯下調(diào)，并參與胃癌細胞的增殖、凋亡及遷移，但其具體作用機制尚不明確，下一步我們將使用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測并驗證其在胃癌中作用的具體機制。

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Relationship between miR-486-5p and biological behavior of gastric carcinoma SGC7901 cells

LI Ming1, LIAN Hai-feng1, LIU Cheng-xia1, HU Ying-bin1, LI You-jie2(1.Department of Digestive, the Af fi liated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou Shandong 256603, China; 2.Key Laboratory of Tumor Molecular Biology, Binzhou Medical University, Yantai Shandong 264003, China)

LIU Cheng-xia E-mail: phdlcx@163.com

Background and purpose:MicroRNA-486-5p (miR-486-5p) has been demonstrated to play an important role in many kinds of tumor, however, there are few reports about the relationship between miRNA-486-5p in gastric carcinoma. This study was aimed to explore the effect of miR-486-5p on the proliferation, apoptosis and migration abilities of the human gastric cancer cell line SGC7901.Methods:Quantitative real-time PCR (qRTPCR) analysis was performed to detect the expression of miR-486-5p in the SGC7901 and GES-1 cells, miR-486-5p over-expressing plasmid was constructed and transfected into the human gastric carcinoma cell line SGC7901 using LipofectamineTM2000. The expression of miR-486-5p of the transfected cells was measured by qRT-PCR, the proliferation level of SGC7901 cells was detected by MTT method, the apoptosis rate of the cells was measured by fl ow cytometry and the in vitro migration abilities of SGC7901 cells by transwell test.Results:The miR-486-5p expression in SGC7901 cells was down-regulated compared with GES-1 cells. The expression of miR-486-5p in SGC7901 cells that was transfected miR-486-5p over-expressing plasmid was obviously up-regulated. The proliferation and migration abilities of SGC7901 cells were inhibited signi fi cantly, and the apoptosis rate of the cells increased.Conclusion:miR-486-5p can effectively suppress the proliferation and in vitro migration abilities of SGC7901 cells, indicating that miR-486-5p might be used as a target for molecular therapy of gastric cancer.

Gastric carcinoma; miR-486-5p; Proliferation; Apoptosis; Migration abilities

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.04.006

R73-37

A

1007-3639(2014)04-0273-06

2013-11-17

2014-01-14）

山東省高?？萍加媱?No：J11LF75)；濱州醫(yī)學(xué)院科研啟動基金(No：BY2010KYQD02)。

劉成霞 E-mail:phdlcx@163.com

*：現(xiàn)在濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院消化內(nèi)科工作。