楊廣東 任淵 張蓉

1.南方醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510665；2.南方醫(yī)科大學附屬奉賢醫(yī)院婦產科，上海 201499；3.江蘇省常州市婦幼保健院婦產科，江蘇 常州 213003

SERPINA3在子宮內膜癌中表達上調的臨床意義及功能研究

楊廣東1,2 任淵3 張蓉1,2

1.南方醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510665；2.南方醫(yī)科大學附屬奉賢醫(yī)院婦產科，上海 201499；3.江蘇省常州市婦幼保健院婦產科，江蘇 常州 213003

背景與目的：SERPINA3是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員，已有研究證實其在多種腫瘤細胞中異常表達。然而，它在子宮內膜癌中生物學功能及臨床意義尚不清楚。本研究旨在探討SERPINA3在子宮內膜癌細胞中的功能和子宮內膜癌預后評估中的價值。方法：①收集20對子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織，用實時定量PCR(quantitative real-time PCR)檢測SERPINA3 mRNA在內膜組織中表達情況；②使用免疫組化方法，檢測組織芯片(子宮內膜癌81例和正常對照37例)的SERPINA3表達情況，依據染色結果，用SPSS軟件分析SERPINA3與子宮內膜癌臨床病理特征之間的關系；③檢測5株子宮內膜癌細胞系中SERPINA3的表達情況，選取表達量最高的HEC-1A細胞，利用小片段干擾RNA(small interfering RNA)干擾SERPINA3基因在HEC-1A細胞中的表達；④蛋白質印跡法(Western blot)和qPCR檢測干擾后HEC-1A中SERPINA3基因在mRNA和蛋白水平表達情況，細胞遷移實驗檢測細胞運動能力的變化。結果：①SERPINA3 mRNA在內膜癌中表達明顯高于對照內膜組織(n=20，P＜0.05)；②免疫組化結果顯示SERPINA3在子宮內膜癌中的表達水平高于正常子宮內膜組織(P＜0.001)。SERPINA3的表達水平與子宮內膜癌的臨床分期、腫瘤細胞級別、脈管浸潤、淋巴結轉移之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；③干擾SERPINA3組細胞遷移能力顯著減弱。結論：SERPINA3基因在子宮內膜癌中表達顯著上調，可能與子宮內膜癌的侵襲和轉移等相關。SERPINA3有望成為評估子宮內膜癌預后的生物學標志物，并可能作為子宮內膜癌生物靶向治療的靶標之一。

SERPINA3；子宮內膜癌；組織微陣列；小干擾RNA干擾；遷移

Migration

子宮內膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌、肺癌及結直腸腫瘤，目前認為與生活方式密切相關［1］。在北美，僅美國2010年就約有43 470新發(fā)患者和7 950死亡患者，位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首［2］。在我國，隨著社會的發(fā)展和經濟條件的改善，子宮內膜癌的發(fā)病率亦逐年升高，目前僅次于宮頸癌，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位。SERPINA3是屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族A亞型，由423個氨基酸組成，包括一個位于氮端的信號肽以及一個具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的serpin結構域；有多個糖基化位點，總相對分子質量為55×103～66×103［3］。據文獻報道，SERPINA3與炎性反應、阿爾茨海默氏病、惡性黑色素瘤、胃癌以及結腸癌等相關［4］。SERPINA3還能夠進入細胞核與DNA結合促進染色質濃縮，抑制細胞分裂，進而阻滯細胞增殖［5］。為探尋子宮內膜癌新的治療靶標提供依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

子宮內膜癌細胞A N 3 C A、K L E、Ishiakawa、HEC-1A和ECC-1購于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；siRNA瞬轉片段及RNAi Mate轉染試劑購于上海吉瑪公司；TRIzol購于美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒，購于德國Qiagen公司；Prime Script RT reagent Kit SYBR Premix Ex Taq試劑盒購于Takara公司(大連寶生物)； SERPINA3兔抗人多克隆抗體和GAPDH鼠抗人單克隆抗體分別購于Abcam和Proteintech公司；山羊抗兔二抗購于武漢博士德公司；IRDye 800兔二抗和IRDye 680鼠二抗購于美國LI-COR公司；細胞培養(yǎng)DMEM/F12培養(yǎng)基、McCoy’5A培養(yǎng)基、PRMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰蛋白酶購于美國GIBCO公司。Transwell小室購于德國Millipore公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

AN3CA、KLE、Ishikawa細胞培養(yǎng)在DMEM/F12培養(yǎng)基；HEC-1A細胞培養(yǎng)于McCoy’5A培養(yǎng)基，ECC-1細胞培養(yǎng)于PRMI-1640培養(yǎng)基，所有細胞培養(yǎng)基中都含有10% (V/V)胎牛血清(FBS)，100 U/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素，在37 ℃，CO2體積分數為5%，100%濕度培養(yǎng)箱中溫育。

1.3 標本收集

收集2007年10月—3013年5月在南方醫(yī)科大學附屬奉賢醫(yī)院和常州婦幼保健院的81例子宮內膜癌組織和37例同期因子宮肌瘤行子宮切除術的正常內膜組織石蠟標本，用于構建組織芯片，其各取20例子宮內膜癌和正常內膜新鮮組織標本用于提取總RNA，本研究選擇的子宮內膜癌患者均有隨訪信息和臨床數據完整。所有子宮內膜癌患者均接受改良根治性子宮切除術或全子宮切除術，聯合雙側輸卵管、卵巢切除和盆腔淋巴結清掃，有或無腹主動脈旁淋巴結取樣，手術前均未接受過放化療，激素治療或其他相關的抗腫瘤治療。同期因子宮肌瘤行子宮切除術的正常增生期子宮內膜(15例)和分泌期子宮內膜(22例)石蠟標本和各10例新鮮組織被選為對照組。新鮮標本離體后迅速至于液氮中，-80 ℃保存。子宮內膜癌的診斷和組織學分類采用國際婦產科協(xié)會(FIGO)分期標準和世界衛(wèi)生組織(WTO)提出腫瘤分級標準進行?；颊叩呐R床資料和特征見表1。組織標本的收集經患者簽署知情同意書，并通過2所醫(yī)院人體研究倫理委員會審核許可。

表1 內膜癌患者及正常子宮內膜基本臨床信息Tab. 1 Clinical characteristics of normal endometrial tissues and patients with endometrial cancer

1.4 組織芯片的構建

選取并標記HE切片上具有代表性的腫瘤區(qū)域、正常內膜組織相應蠟塊，腫瘤組織，正常對照每例選取2個點。將所需的靶組織用直徑1.0 mm的吸針從供體蠟塊靶區(qū)取出，按芯片設計的排列順序定位裝載在受體蠟塊中。受體蠟塊連續(xù)4 μm切片備用。

1.5 免疫組織化學染色

白片經70 ℃烤制1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水后行抗原修復，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0) 100 ℃抗原修復10 min。1∶50稀釋的SERPINA3兔抗人多克隆抗體，4 ℃溫育過夜，1∶200山羊抗兔二抗室溫溫育1 h，二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。評分標準：陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞0～10%為0分，陽性細胞＞l0%～30%為1分，陽性細胞＞30%～60%為2分，陽性細胞＞60%為3分。腫瘤2個點染色不一致時以高評分為準。由2名病理醫(yī)師雙盲閱片和評分，結果一致者為最后判定結果。將結果分為2組：0～1分為低表達，2～3分的為高表達。

1.6 實時定量PCR

使用TRIzol試劑提取細胞和組織中總RNA，根據制造商的說明書通過PrimeScript RT試劑盒通過反向逆轉錄PCR(rt-PCR)獲得cDNA，反應條件為37 ℃，30 min；85 ℃，5 s。隨后用ABI7300儀上進行實時聚合酶鏈反應(real-time PCR)。引物如下：SERPINA3基因上游引物5’-TGCCAGCGCACTCTTCATC-3’，下游引物5’-TGTCGTTCAGGTTATAGTCCC TC-3’；GAPDH基因上游引物5’- TGCGAG TACTCAACACCAACA-3’，下游引物5’-GCATA TCTTCGGCCCACA-3’。兩步法PCR擴增總反應體系20 μL，各管分別含GAPDH或SERPINA3上下游引物0.8 μL，cDNA 7.6 μL，SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μL，Rox Reference Dye(50×) 0.4 μL；PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，40個循環(huán)。擴增過程、熒光信號檢查、數據儲存和分析均由ABI7300型PCR儀自帶軟件自動完成，所獲數據導至Excle進行計算和分析。

1.7 蛋白質印跡法(Western blot)檢測

收集細胞，以含有100 μmol/L PMSF的細胞裂解液裂解細胞，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液采用Bradford法進行蛋白質定量。取50 μg蛋白上樣，經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶37 ℃ 封閉1 h，分別加1∶500稀釋的SERPINA3抗體和1∶10 000稀釋的GAPDH抗體4℃過夜，1∶10 000稀釋的IRDye 800兔二抗或1∶20 000稀釋的IRDye 680鼠二抗在室溫溫育1 h后，由Odyssey紅外成像系統(tǒng)檢測。實驗重復3次。

1.8 瞬轉干擾細胞轉染試驗

HEC-1A細胞生長至80%融合時傳代。轉染前l(fā) d，將對數生長期的細胞(1×105)接種于6孔培養(yǎng)板，每孔所加培養(yǎng)基為1.5 mL。轉染時，細胞匯合率為40%～50%。每個細胞收集時間點設3個平行孔。配制工作母液：在含有的雙鏈siRNA干粉中加入125 μL的DEPC水，得到濃度為20 μmol/L的siRNA母液。將RNAi Mate試劑輕柔搖勻，取5 μL RNAi Mate試劑和20 μmol/L的siRNA母液分別與50 μL Opti-MEM混合。把稀釋后的siRNA與稀釋后的RNAi Mate進行混合，形成siRNA與RNAi Mate稀釋液的轉染復合物，混合液加入培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)6～8h換液。

1.9 Transwell小室體外遷移實驗

細胞轉染24 h后，胰酶消化，用無血清的DMEM/F12空培配制成4×105/mL的細胞懸液。將微孔直徑為8 μm的Transwell細胞趨化小室置于24孔板中，上室種入100 μL細胞濃度為4×105/mL細胞懸液，下室周圍加0.7 mL含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。每種細胞設3個復孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽小心拭去濾膜上層剩余細胞，4%多聚甲醛固定30 min，晾干后，1%結晶紫染色30 min。取下微孔濾膜，反面朝上，用中性樹膠固定于載玻片上。200倍光鏡下隨機取5個視野計數膜背面的穿膜細胞，取平均數。實驗重復3次。

1.10 統(tǒng)計學處理

實驗數據采用SPSS11.0軟件進行χ2檢驗，Fisher確切概率法以及 t 檢驗。數據如需描述均以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SERPINA3基因在子宮內膜癌組織中表達上調

實時定量PCR檢測20例正常子宮內膜組織和20例子宮內膜癌組織中SERPINA3基因表達差異情況，結果顯示在mRNA水平上，SERPINA3 mRNA在子宮內膜癌組織中的表達顯著高于正常子宮內膜組織(P＜0.05，圖1)。

2.2 SERPINA3與子宮內膜癌病理分級、臨床分期、脈管浸潤和淋巴結轉移密切相關

免疫組化檢測結果顯示，SERPINA3在子宮內膜癌中的表達顯著高于正常子宮內膜組織(P＜0.05，表2、圖2)。分析SERPINA3表達情況與內膜癌臨床病理參數之間的關系，發(fā)現SERPINA3的表達水平與子宮內膜癌病理分級、臨床分期、脈管浸潤、淋巴結轉移之間有密切的相關性(表2)。在Ⅰ期內膜癌患者中SERPINA3高表達的患者約占35.8%(n=53)，而在Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者中，分別高達71.4%(n=14)和92.8%(n=14)，三者之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，表明SERPINA3表達升高與腫瘤的進展相關；在低分化的內膜癌(G3)中SERPINA3表達明顯高于高分化的內膜癌組織(G1)，SERPINA3高表達比率分別為69.6%(n=23)和36.8%(n=19)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.034)。發(fā)生淋巴結轉移的患者中SERPINA3均為高表達(n=6)，未發(fā)生淋巴結轉移的患者中明顯降低，為48%(n=75)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)。有脈管癌栓的患者中SERPINA3高表達率達81.8%(n=11)，而未發(fā)生脈管浸潤的為47.1%(n=70)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.049)。

2.3 SERPINA3 mRNA在內膜細胞系中表達水平檢測及小片段干擾RNA干擾效率驗證結果

為了進一步研究SERPINA3在子宮內膜癌細胞系中的表達情況，選擇AN3CA、KLE、Ishiakawa、HEC-1-A和ECC-1，5株常用的子宮內膜癌細胞株，利用實時定量PCR的方法檢測其SERPINA3 mRNA表達情況。結果顯示，HEC-1A細胞中SERPINA3 mRNA的表達最高(圖3A)。采用實時熒光定量PCR檢測，含3條SERPINA3特異小片段干擾RNA(siRNA)轉染子宮內膜癌細胞HEC-1A后SERPINA3基因的mRNA水平表達變化。采用公式2-ΔΔCT值計算，設轉染無義片段的HEC-1A細胞(對照組)SERPINA3基因表達量為1，則2-ΔΔCT為轉染后SERPINA3基因較未轉染基因表達量的倍數，發(fā)現siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組，SERPINA3 mRNA的表達量分別為27%、15%和20%(圖3B)。說明3條SERPINA3基因特異小片段干擾序列對SERPINA3基因均有抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義。Western blot檢測結果顯示，3對siRNA片段均能顯著下調HEC-1A細胞SERPINA3蛋白表達水平(圖3C)。在隨后的實驗中選用siRNA2和siRNA3作為干擾組。

2.5 干擾SERPINA3基因后HEC-1A細胞遷移能力明顯減弱

懸浮于上室無血清空培中的腫瘤細胞為了逃避凋亡，向含有10%血清的完全培養(yǎng)基方向移動，以24 h內穿過Transwell小室膜細胞數表示細胞的體外遷移能力。結晶紫染色后鏡下可見穿膜細胞核呈藍色，實驗組穿膜細胞數量明顯較對照組少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明轉染siRNA靶向干擾SERPINA3后，HEC-1A細胞遷移能力明顯降低(圖4)。

圖1 20對正常子宮內膜和子宮內膜癌組織SERPINA3表達分析Fig. 1 SERPINA3 expression was analyzed in 20 pairs of normal endometrial and endometrial cancer tissues

表2 SERPINA3表達水平與子宮內膜癌臨床病理特征關系分析Tab. 2 Association of SERPINA3 expression level with the clinical parameters

圖2 免疫組化檢測正常內膜和子宮內膜癌組織中SERPINA3表達(SP法，組織芯片)Fig. 2 Immunohistochemical detection of normal endometrium and endometrial carcinoma SERPINA3 expression (SP method, tissue microarray)

圖3 5株內膜癌細胞系SERPINA3表達情況及瞬轉干擾HEC-1A細胞SERPINA3表達效率驗證Fig. 3 The expression of SERPINA3 in 5 endometrial cancer cell lines and evaluate the ef fi ciency of interference in HEC-1A cells

圖4 SERPINA3對HEC-1A細胞遷移能力的影響Fig. 4 SERPINA3 impact on migration of HEC-1A cells

3 討 論

子宮內膜癌是世界范圍內女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。在歐盟國家，每年有81 500例新發(fā)患者，全球范圍內，子宮內膜癌在女性惡性腫瘤中列第7位［6-7］。雖然女性早期子宮內膜癌的預后相對較好，但仍然有部分患者因復發(fā)或轉移而導致預后不良，而且子宮內膜癌發(fā)病率上升且呈低齡化趨勢［8］。我們迫切需要進一步研究子宮內膜癌發(fā)生、發(fā)展的機制為臨床治療提供有益的指導。在國內，關于SERPINA3與子宮內膜癌發(fā)病相關的研究性文章還鮮有報道。本研究結果證實，SERPINA3在子宮內膜癌組織中高表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，而且體外細胞功能實驗也與此一致。

SERPINA3表達于各種腫瘤細胞中，如：乳腺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、唾液腺腺腫瘤以及肺腺癌，但SERPINA3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚［9］。本研究通過組織芯片篩查，發(fā)現SEPINA3在內膜癌中表達顯著高于正常內膜組織。進一步分析其與子宮內膜癌相關臨床病理特點，發(fā)現SERPINA3與子宮內膜癌病理分級、臨床分期、脈管癌栓和淋巴轉移等運動能力相關，通過siRNA干擾SERPINA3表達后細胞遷移能力明顯降低。

最近的一些研究其他類型的腫瘤都支持高SERPINA3是不良預后的標志物：例如SERPINA3作為炎性反應信號轉導通路上的蛋白之一，在復發(fā)性卵巢腫瘤中表達上調，可能在卵巢癌的進展和化療耐藥中發(fā)揮重要作用［10］；有研究顯示在人胎盤疾病中SERPINA3表達上調與基因的5’區(qū)域的甲基化相關，研究者通過在絨毛膜癌JEG-3細胞中過表達SERPINA3后觀察到細胞免于凋亡［11］；此外，已發(fā)現肝癌、胰腺癌和前列腺癌患者血漿SERPINA3的含量增高［12-13］。

子宮內膜癌仍然是一個缺乏有針對性治療的惡性腫瘤。雖然早期子宮內膜癌子宮切除后，為一部分內膜癌患者提供了治愈的可能，然而子宮內膜癌患者總生存率并沒有顯著改善［14］。有效的生物靶向治療將可能提高部分內膜癌患者的生存時間和延長復發(fā)時間［15］。淋巴結轉移和脈管浸潤是子宮內膜癌獨立的預后因素［16-17］，本研究結果還證實SERPINA3與之密切相關。由此推測SERPINA3可能是子宮內膜癌預后不良的標志物。

總之，SERPINA3有望成為評估子宮內膜癌預后的生物學標志物，并可作為子宮內膜癌生物靶向治療的靶標之一。

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Identify effect of SERPINA3 up-regulated expression in endometrial cancer

YANG Guang-dong1,2, REN Yuan3, ZHANG Rong1,2(1. Third Clinical Medical College of Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510665, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, Fengxian Hospital, Southern Medical University, Shanghai 201499, China; 3. Department of Obstetrics and Gynecology, Changzhou Maternal and Child Care Hospital, Changzhou Jiangsu 213003, China)

ZHANG Rong E-mail: rongzhang@163.com

Background and purpose:SERPINA3 is a protease inhibitor, belonging to the serpin super family. It has been reported that SERPINA3 expression up-regulated in various tumor cells. However, its clinical significance and biological function in endometrial cancer remains unclear. This study was aimed to investigate the effect and prognosis value of up-regulated SERPINA3 (α1-ACT) in endometrial cancer.Methods:①We collected 20 pairs of endometrial carcinoma and normal endometrial tissues then extracted total RNA, detected SERPINA3 mRNA expression by quantitative real-time PCR; ②Immunohistochemistry was used to detect the expression of SERPINA3 in tissue chip which contained 81 endometrial cancer tissue samples and 37 normal controls endometrial tissues, based on the results, using SPSS software to analyze the relationship between SERPINA3 expression with clinicopathological features of endometrial cancer;③The highest SERPINA3 expression was selected from 5 endometrial cancer cells, then small interfering RNA targeted interference SERPINA3 gene expression; ④With real-time quantitative PCR and Western blotmethods, we detected SERPINA3 gene expression in mRNA and protein levels after interference, at last, analyzed cell motility by cell migration assay.Results:①SERPINA3 mRNA expression in endometrial carcinoma was signi fi cantly higher than the control endometrial tissue (n=20, P＜0.05); ②Immunohistochemistry also showed SERPINA3 expression in endometrial carcinoma higher than in normal endometrial tissues (P＜0.001). The analysis showed that between the expression level of SERPINA3 with endometrial cancer clinical stage, tumor differentiation, vascular invasion, lymph node metastasis, there was a close correlation (P＜0.05); ③Interference expression of SERPINA3, endometrial cancer cells migration was signi fi cantly reduced.Conclusion:SERPINA3 gene expression in endometrial carcinoma was signi fi cantly increased and correlated with endometrial cancer invasion and metastasis; SERPINA3 is expected to become the pathological marker of diagnosis and determination in the prognosis of endometrial cancer. It may be used as one of the biological target of endometrial cancer targeted therapy.

SERPINA3; Endometrial cancer; Tissue microarrayer; Small interfering RNA interference;

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.04.008

R737.33

A

1007-3639(2014)04-0284-08

2013-12-24

2014-03-05）

上海市衛(wèi)生局重點科研課題（No：2010249）。

張蓉 E-mail:rongzhang@163.com