秦晶晶，李齊激，薛 琰，馬 琳，楊小生，*

（1.貴州大學藥學院，貴州貴陽550002；2.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州貴陽550002）

刺梨總三萜提取方法及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

秦晶晶1，2，李齊激2，薛 琰2，馬 琳2，楊小生1，2，*

（1.貴州大學藥學院，貴州貴陽550002；2.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州貴陽550002）

以藥食兩用植物刺梨為對象，研究不同提取方法對提取刺梨總三萜影響及其最佳方法下總三萜的α-葡萄糖苷酶抑制活性。通過采用5種不同提取方法（水煮醇沉法、回流提取法、大孔樹脂法、浸漬法、超臨界萃取法）對總三萜提取率，α-葡萄糖苷酶抑制模型對總三萜抑制活性進行考察。結果表明，回流提取法刺梨總三萜提取率最高，為0.53%；其三萜總提物經(jīng)處理所得A、B部分α-葡萄糖苷酶抑制活性較好（IC50值分別為9.6、3.4μg/mL），活性遠優(yōu)于陽性對照阿卡波糖（IC50=75.2μg/mL）。該提取方法經(jīng)濟、方便、適合工業(yè)化生產(chǎn)，且三萜總提物具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

刺梨總三萜，提取方法，α-葡萄糖苷酶抑制活性

刺梨為薔薇科薔薇屬植物繅絲花Rosa roxburghii Tratt.的果實，又名送春歸，主要分布于我國西南地區(qū)，以貴州省資源最為豐富，為少數(shù)民族用藥，具有消食健脾，收斂止瀉的功效，主要用于治療積食腹脹，泄瀉等疾病[1]。經(jīng)現(xiàn)代研究表明，刺梨中主要含有三萜、黃酮、多糖、維生素等化學成分，因富含維生素C、維生素P和超氧化物歧化酶（SOD）被稱為“三王水果”，其維生素C含量是獼猴桃的10倍[2]。另外，刺梨提取物及其三萜成分（如刺梨苷、刺梨酸、野薔薇苷等）在調節(jié)機體免疫功能、延緩衰老、解毒、抗動脈粥樣硬化、抗應激、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制免疫反應的單核細胞增殖、抑制外周血中B細胞、T細胞和巨噬細胞、抑制HIV等方面表現(xiàn)出一定的藥理活性[3-10]。

目前，提取生物活性總三萜的方法較多，鄧迎娜等[11]利用超聲提取靈芝總三萜，在傳統(tǒng)回流提取法的基礎上提高了總三萜類的提取率，避免了高溫對其組分的破壞；白新鵬等[12]通過微波提取獼猴桃根總三萜一次提取率達85.13%；李金華等[13]用超臨界CO2萃取段木靈芝孢子油中總三萜取得一定效果；此外，還有傳統(tǒng)的煎煮法、浸漬法等[14-15]均發(fā)揮了一定的作用。綜上，不同植物提取總三萜的方法也不盡相同，需結合實際情況進行調整。因此，本文對刺梨總三萜的提取方法及其α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究，為進一步開發(fā)刺梨相關藥、食及保健品提供一定的研究基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料 于2013年9月采自貴州龍里，經(jīng)“貴州大學”安華明教授鑒定為刺梨Rosa roxburghii Tratt.fmalis Rehd.et Wils的成熟果實，標本存放于“貴州省中科院天然產(chǎn)物重點實驗室Lab8號實驗室”；熊果酸 購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110742-200415；α-葡萄糖苷酶 日本OSAKA BIO公司4；硝基苯-α-D-吡喃葡萄苷 Sigma公司；阿卡波糖 德國拜耳公司；高氯酸 為優(yōu)極純；香草醛、冰乙酸、無水乙醇 均為分析純。

HP-8453型雙光束紫外可見分光光度計 美國惠普公司；FA 114型萬分之一電子天平 上海?？惦娮觾x器廠；電熱恒溫水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器廠；Max-190型酶標儀 美國Molecular Devices公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海博泰實驗設備有限公司；旋轉蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司；96孔板細胞 美國Corning Costar Cambridge M公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同提供方法供試品的制備

1.2.1.1 水煮醇沉法 取刺梨粗粉約200g，按游澤芳[16]方法制備，濃縮干燥得總提物13.59g。精密稱取總提物0.27g加適量甲醇定容于25mL容量瓶，搖勻，即得。

1.2.1.2 回流提取法 取刺梨粗粉約200g，參考南瑩等[17]方法并稍作修改，加250mL乙醇回流提取，每次2h，重復3次，合并濾液，濃縮至無醇味，加適量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，加適量水沉淀后，濾過，得沉淀物A和溶液B，分別濃縮干燥即得總提物A（400mg）、B（650mg）。再分別精密稱取A（25mg）、B（13mg）加適量甲醇定容于25mL容量瓶，搖勻，即得。

1.2.1.3 大孔樹脂法 取刺梨粗粉約200g，按游澤芳[16]方法制備，收集70%乙醇洗脫部分，濃縮干燥即得干燥物1g，精密稱取0.175g加適量甲醇定容于25mL容量瓶，搖勻，即得。

1.2.1.4 浸漬法 取刺梨粗粉約200g，按楊愛梅等[18]方法制備，得總浸膏0.5g，精密稱取38mg后加適量甲醇定容于25mL容量瓶，搖勻，即得。

1.2.1.5 超臨界萃取法 取刺梨粗粉約200g，加入萃取釜中，參考李加興等[19]方法稍作修改，在萃取壓力18、23、25MPa，萃取溫度45℃，解析壓力5MPa，解析溫度50℃條件下進行超臨界流體萃取，萃取物干燥即得2.10g，精密稱取0.27g后加適量甲醇定容于25mL容量瓶，搖勻，即得。

1.2.2 不同提取方法中刺梨總三萜的含量測定

1.2.2.1 刺梨總三萜標準曲線的繪制 精密稱取熊果酸對照品10mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻即得濃度為0.11mg/mL的對照品溶液。精密吸取熊果酸對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6mL置于試管中，100℃水浴蒸干甲醇，加0.40mL香草醛-冰乙酸溶液和1.00mL高氯酸，在60℃水浴加熱15min后，移入冰水浴中，再加入5.00mL冰乙酸，搖勻，在545nm處測定吸收值。以熊果酸濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程，計算R2。

1.2.2.2 精密度實驗 分別精密吸取6份對照品溶液0.7mL，按1.2.2.1項下方法進行處理并測定吸光度值，計算RSD值。

1.2.2.3 穩(wěn)定性實驗 分別精密吸取6份1.2.1.2項下供試品溶液0.2mL，分別于0、2、4、6、8、10h按1.2.2.1項下方法測定吸光度值，計算RSD值。

1.2.2.4 重復性實驗 分別精密吸取6份1.2.1.2項下供試品溶液0.2mL，按1.2.2.1項下方法測定吸光度值，計算RSD值。

1.2.2.5 加樣回收率實驗 分別取1.2.1.2項下已知總三萜含量（69.87%）的樣品6份，約18mg，精密稱定，按1∶1比例加入對照品，按1.2.2.1項下方法操作，測定吸光度值，計算平均值及RSD值。

1.2.2.6 樣品的含量測定 分別精密吸取1.2.1項下供試品溶液0.2mL于具塞試管中，按1.2.2.1項下方法測定吸光度值（A），運用回歸方程計算樣品含量。

1.2.3 刺梨總三萜α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選

1.2.3.1 供試品的選擇 根據(jù)樣品含量測定結果，優(yōu)先選擇刺梨總三萜含量較高的1.2.1.2項下樣品進行測定。

1.2.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性檢測方法 參考楊付梅等[20]方法并稍作修改：反應體系，96孔板上加入80μL磷酸二氫鈉緩沖液（pH6.9），再加入10μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.1U/mL）和10μL樣品溶液，混勻，37℃恒溫10min后，加入20μL PNPG（2.5mmol/L），37℃恒溫反應15min，最后加入40μL的Na2CO3（1mol/L），在405nm波長下測定OD值。

以阿卡波糖（Acarbose）為陽性對照，同時設定陰性對照組（緩沖液+酶液），空白對照（緩沖液）。按下式計算酶活性抑制率：

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均為3次重復實驗結果的平均值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPASS 11.5進行，繪圖采用Mircrosoft Excel 2007進行，數(shù)值表示為平均值x±SD。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 標準曲線的制備 以熊果酸濃度x（μg/mL）為橫坐標，吸光度y（A）為縱坐標，通過線性擬合得回歸方程為y=0.0054x+0.0434，相關系數(shù)R2=0.9997大于0.99，標準曲線見圖1。結果表明熊果酸質量-吸光度線性關系良好。

表1 精密度實驗結果（n=6）Table 1 The results of precision test（n=6）

表2 穩(wěn)定性實驗結果（n=6）Table 2 The results of stability test（n=6）

表3 重復性實驗結果（n=6）Table 3 The results of repeatability test（n=6）

表4 刺梨提取物A的加樣回收率（n=6）Table 4 Recoveries of Rosa roxbughii extraction A（n=6）

圖1 標準曲線圖Fig.1 The figure of standard curve

2.1.2 精密度實驗 熊果酸標準品溶液精密度實驗結果見表1，計算相對標準偏差值（RSD）為1.89%（n=6）小于2%，表明該實驗精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實驗 刺梨供試品溶液穩(wěn)定性實驗結果見表2，計算RSD值為1.24%（n=6）小于2%，表明樣品在10h內穩(wěn)定。

2.1.4 重復性實驗 刺梨供試品溶液重復性實驗結果見表3，計算相對標準偏差RSD值為0.45%（n=6）小于2%，表明該實驗重復性良好。

2.1.5 加樣回收率實驗 刺梨供試品回收率實驗結果見表4，計算平均加樣回收率為99.21%，RSD為1.41%（n=6）小于2%，表明該實驗加樣回收率較好。

2.1.6 不同提取方法中總三萜的含量 按1.2.2.1項下方法對1.2.1項對供試品進行總三萜含量測定，計算結果見表5。

表5 不同提取法中總三萜的含量（x±SD，n=3）Table 5 Different extraction methods on the determination of total saponins（x±SD，n=3）

由表5可知，5種提取方法中超臨界萃取法提取率最高，為1.05%±0.01%，但總三萜含量較低，為10.02% ±0.10%；回流提取法提取率適中，但含量最高70.86% ±0.40%。綜合比較幾個方法提取率與總三萜含量，回流提取法為刺梨總三萜最佳提取方法，綜合提取效果最好。

2.2 刺梨總三萜體外α-葡萄糖苷酶抑制活性

刺梨總三萜提取物A、B體外α-葡萄糖苷酶抑制活性結果見表6。

由表6可知，與陽性對照阿卡波糖（IC50值為75.2μg/mL）比較，刺梨提取物A、B的分別為9.6、3.4μg/mL，均表現(xiàn)出較好的抑制活性。

3 討論

3.1 刺梨總三萜提取方法的選擇

表6 刺梨總三萜α-葡萄糖苷酶抑制活性（x±SD，n=6）Table 6 α-glucosidase inhibitory activity of total saponins in Rosa roxbughi（ix±SD，n=6）

刺梨三萜作為該植物的活性成分之一，主要由多取代羥基熊果烷型五環(huán)三萜及其苷類物質組成，其中刺梨三萜皂苷以含單糖鏈為主，在乙醇-水中具有較好的溶解性。之前已有文獻[11-12]報道超聲、微波提取總三萜有諸多優(yōu)點，且提取效率也高，但本實驗結果顯示該方法并不適合提取該植物中總三萜。為更好地探索刺梨總三萜的最佳提取方法，本實驗結合該植物三萜類成分自身特點和類似文獻[16-19]方法，選擇其中最常用的5種提取方法加以改進來考察刺梨總三萜的含量變化，結果顯示超臨界萃取法提取率最高1.05%±0.01%，但含量較低10.02%±0.10%，且設備較貴，綜合利用率低；回流提取法提取率雖然適中，但含量最高（約70%），且經(jīng)濟、簡單、易于工業(yè)化生產(chǎn)，綜合提取效率也高。綜合比較5種方法的提取率與總三萜含量，結合工業(yè)化生產(chǎn)實際，最終認為回流提取法可作為刺梨總三萜的最佳提取方法。

3.2 刺梨總三萜對α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制活性

眾所周知，α-葡萄糖苷酶抑制劑是防治餐后高血糖癥及緩解高胰島素血癥的重要抑制劑之一，應用前景十分廣闊。與天然水果肉桂、荔枝、胡柚α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC50分別為350.37μg/mL、80、25.42mg/mL）比較[21-23]，本實驗所建模型陽性對照阿卡波糖IC50值（75.2μg/mL）較小，靈敏度高，具有較好的重復性和可操作性。

4 結論

刺梨作為我國重要的藥食兩用植物資源，資源十分豐富，大面積種植栽培，其天然植物保健功能值得深入研究與開發(fā)。通過對不同提取方法下刺梨總三萜的含量進行測定，綜合考察其利用效率，可將回流提取法作為刺梨總三萜的最佳提取方法，該方法綜合利用率高、經(jīng)濟節(jié)約、便于實現(xiàn)，且體外α-葡萄糖苷酶抑制活性較好，該初步活性測試結果可為刺梨高值化利用與開發(fā)提供參考。

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Study on extraction methods and α-glucosidase inhibitory activity from the total triterpenes of Rosa roxbughii

QIN Jing-jing1，2，LI Qi-ji2，XUE Yan2，MA Lin2，YANG Xiao-sheng1，2，*
（1.Guizhou University College of Pharmacy，Guiyang 550002，China；2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China）

The extraction yield of total triterpenes from R.roxbughii that was extracted by different extraction methods and the α-glucosidase inhibition activities of the best extraction of total triterpenes was studied.To investigate the extraction yield of total triterpenes to extract by five different extraction methods（water boiling and precipitation with ethanol，refluxing process，macro absorption resin，impregnation method，supercritical fluid extraction），and to evaluate the highest extraction yield of the total triterpenes against α-glucosidase inhibition activities.The results showed that the total triterpene’s extraction yield of refluxing process were higher than the other extraction methods，CoMParing with acarbose，the extractions A and B had preferable inhibition activities against α-glucosidase，and their IC50values were 75.2，9.6，3.4μg/mL，respectively.This method was economy，convenience and appropriate for commercial process，and the total triterpenes had preferable inhibition activities against α-glucosidase.

total triterpenes；extraction method；α-glucosidase inhibition activity

TS255.1

A

1002-0306（2014）10-0186-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.033

2013－12－11 *通訊聯(lián)系人

秦晶晶（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：藥食兩用植物營養(yǎng)保健功能。

國家973計劃前期預研項目（2012CB722601）；貴州省科技重大專項（2013-6006）；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊建設項目（2013-4006）。