周中和，楊 璐，李 巍，李鳳鵬，曲 方，韓雅玲，陳會生

經(jīng)腹腔聯(lián)合阿加曲班和依達拉奉對腦出血大鼠神經(jīng)損傷的影響

周中和，楊 璐，李 巍，李鳳鵬，曲 方，韓雅玲，陳會生

目的探討經(jīng)腹腔聯(lián)合應用阿加曲班和依達拉奉對腦出血大鼠神經(jīng)損傷的影響。方法 建立大鼠自體血腦出血模型，隨機分為腦出血組、阿加曲班組、依達拉奉組、阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組，每組18只。阿加曲班組術(shù)后即刻和12 h分別經(jīng)腹腔給予阿加曲班干預1次;依達拉奉組術(shù)后經(jīng)腹腔注入依達拉奉，12 h 1次，連用3 d;阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組術(shù)后即刻和12 h分別經(jīng)腹腔給予阿加曲班干預1次，術(shù)后12 h經(jīng)腹腔注入依達拉奉，12 h 1次，連用3 d;腦出血組術(shù)后經(jīng)腹腔注入生理鹽水，12 h 1次，連用3 d。造模后及處死前進行神經(jīng)功能缺損評分(NDS)，處死后檢測4組TUNEL陽性細胞數(shù)、Caspase-3免疫反應細胞數(shù)及腦組織水含量、血腫周圍腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果 阿加曲班組、依達拉奉組和阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組處死前NDS、TUNEL陽性細胞數(shù)、Caspase-3陽性細胞數(shù)、腦組織水含量、MDA含量均低于腦出血組，SOD活性高于腦出血組，且阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組上述指標改善情況優(yōu)于阿加曲班組和依達拉奉組(P＜0．05，P＜0．01)。結(jié)論 經(jīng)腹腔應用阿加曲班或依達拉奉均可有效地減輕腦出血后的腦水腫、細胞凋亡性損傷以及自由基損傷，二者聯(lián)合應用效果更佳。

腦出血;阿加曲班;依達拉奉;大鼠，Wistar

腦出血是全球范圍內(nèi)威脅人類健康的嚴重疾病，目前尚缺乏有效的針對性治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，血凝塊的毒性作用是腦出血后神經(jīng)損傷的重要原因，其中凝血酶的神經(jīng)毒性作用以及血紅蛋白分解產(chǎn)物等誘發(fā)的自由基損傷是腦出血患者致殘的主要機制［1］。有報道針對這兩種神經(jīng)損傷機制采用兩種不同類型的藥物聯(lián)合治療蛛網(wǎng)膜下腔出血效果良好［2］，但對于治療腦出血的效果尚未見相關(guān)報道。另有研究報道，單獨應用凝血酶抑制劑(阿加曲班)或自由基清除劑(依達拉奉)可以減輕腦出血后的神經(jīng)損傷［3-7］。本研究建立實驗大鼠自體血腦出血模型，經(jīng)腹腔單用或聯(lián)合應用阿加曲班和依達拉奉，檢測大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損評分、腦組織水腫、細胞凋亡性損傷以及超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量變化，以期探索針對性的更有效的腦出血治療手段。

1 材料與方法

1.1 器材與試劑 江灣Ⅱ型動物頭顱立體定位儀(上海第二軍醫(yī)大學);50μl微量進樣器(浙江省醫(yī)用器材廠);圖像分析系統(tǒng)(德國Leica-MD20);電子天平(上海TG332A型);721分光光度計(上海精密儀表有限公司);阿加曲班溶液(天津藥物研究院，10 mg/20 ml);依達拉奉溶液(南京先聲藥業(yè)，30 mg/10 ml);SOD和MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所);Caspase-3山羊抗鼠一抗(武漢Boster公司)，TUNEL試劑盒(Roche)。

1.2 動物與分組 Wistar大鼠72只(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心提供)，雌雄不限，鼠齡10～12個月，體重250～300 g。隨機分為腦出血組、阿加曲班組、依達拉奉組、阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組，每組18只，其中6只用于腦水腫檢測，6只用于TUNEL以及Caspase-3免疫反應細胞檢測，6只用于SOD活性以及MDA含量檢測。

1.3 動物模型制備與給藥方法 采用“二次注血二次退針法”［8］，將50μl大鼠尾血注入大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)建立腦出血模型。所有大鼠模型制備完成后予正常相同條件下飼養(yǎng)，模型制備72 h后處死。阿加曲班組術(shù)后(大鼠顱骨頭皮縫合完畢)即刻經(jīng)腹腔注入阿加曲班0．9 mg/kg，12 h后再次經(jīng)腹腔注入相同劑量阿加曲班1次;依達拉奉組術(shù)后即刻經(jīng)腹腔注入依達拉奉6 mg/kg，以后每12 h注入1次，連續(xù)3 d;阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組術(shù)后即刻和12 h經(jīng)腹腔各給予阿加曲班0．9 mg/kg干預1次，同時經(jīng)腹腔注入依達拉奉6 mg/kg，以后每12 h注入1次，連續(xù)3 d，3組阿加曲班和依達拉奉總注入量均為0．6 ml，不足部分均由生理鹽水注射液補充;腦出血組術(shù)后即刻經(jīng)腹腔注入0．6 ml生理鹽水注射液，每12 h注入1次，連續(xù)3 d。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分(NDS)標準 參照Longa FZ 5級評分法［9］:在大鼠腦出血模型制備完成蘇醒后以及在處死大鼠前進行NDS。0級:無體征，記0分;Ⅰ級:動物不能完全伸直其前肢，記1分;Ⅱ級:動物一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象，記2分;Ⅲ級:動物不能站立或打滾，記3分;Ⅳ級:無自發(fā)性活動，有意識障礙，記4分。NDS在1～4分且處死大鼠取腦時可見腦內(nèi)血腫形成，表明腦出血模型制備成功。

1.5 腦水腫測定 切取出血側(cè)半球，測得濕重后，將標本放于95℃烤箱24 h后測干重。干濕重測定采用電子天平。腦組織水腫含量=(濕重－干重)/濕重×100%。

1.6 TUNEL陽性細胞檢測 應用10%水合氯醛腹腔麻醉后開胸，經(jīng)左心室插管至升主動脈，右心耳剪一小口為出口，應用生理鹽水注射液250 ml灌注后，4%多聚甲醛快速推注，見大鼠肢體變硬變白后，迅速斷頭取腦，以注入點為中心前后各2 mm處，冠狀切除大鼠腦額端及枕端，中間部分繼續(xù)于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中4℃固定4～6 h，標本于20%蔗糖多聚甲醛溶液中脫水過夜，再移至4%多聚甲醛溶液中4℃固定2 h，恒溫冰凍切片機連續(xù)切片，片厚5μm，冷丙酮固定30 min，自然晾干。嚴格按Roche公司提供TUNEL染色操作規(guī)程進行，蘇木素復染，胞核棕黃色為陽性細胞，在400倍視野下，觀察目的區(qū)域3個不重復視野的TUNEL陽性細胞，取均值。

1.7 Caspase-3免疫反應陽性細胞檢測 取材切片同TUNEL陽性細胞檢測，采用免疫組化二步法對切片進行染色(Caspase-3山羊抗鼠一抗，按1∶50稀釋;SABC兔抗山羊通用型二抗，1∶1)。光學顯微鏡下觀察，以胞質(zhì)呈棕黃色或褐色為Caspase-3 IR細胞。在200倍視野下，觀察目的區(qū)域3個不重復視野的Caspase-3 IR細胞，取均值。

1.8 SOD和MDA測定 處死大鼠取腦，在冰盤上分離取右側(cè)尾狀核區(qū)血腫周圍腦組織1塊(約3 mm×3mm×3mm)，稱重，加冰生理鹽水配成3%腦組織勻漿，將勻漿以4000 r/min離心10min，取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，分別用721分光光度計在波長550和532 nm處比色測定各管腦組織上清液吸光度值，然后根據(jù)試劑盒說明書計算組織中SOD活性和MDA含量。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13．0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，α=0．05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 NDS變化 4組大鼠造模后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，NDS比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。處死前阿加曲班組、依達拉奉組和阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組NDS均低于腦出血組，且阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組低于阿加曲班組和依達拉奉組(P ＜0．05，P ＜0．01)，見表 1。

2.2 腦水腫、Caspase-3 IR和TUNEL陽性細胞數(shù)腦組織水含量、Caspase-3 IR和TUNEL陽性細胞數(shù)阿加曲班組、依達拉奉組和阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組均低于腦出血組，且阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組低于阿加曲班組和依達拉奉組(P ＜0．05，P ＜0．01)，見表2。

表1 4組腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損評分(±s，分)

表1 4組腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損評分(±s，分)

注:與腦出血組比較，a P ＜0．05，b P ＜0．01;與阿加曲班組比較，c P＜0．05;與依達拉奉組比較，e P ＜0．05

組別 鼠數(shù) 造模后 處死前腦出血組18 2．89 ±0．75 2．78 ±0．65阿加曲班組 18 2．96 ±0．86 1．61 ±0．50a依達拉奉組 18 3．01 ±0．82 1．72 ±0．46a阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組18 2．90 ±0．73 0．94 ±0．54bce

表2 4組腦出血大鼠腦組織水含量和細胞凋亡性損傷情況(±s)

表2 4組腦出血大鼠腦組織水含量和細胞凋亡性損傷情況(±s)

注:*每組18只中6只用于腦水腫檢測，6只用于TUNEL以及Caspase-3免疫反應細胞檢測;與腦出血組比較，a P＜0.05，b P ＜0．01;與阿加曲班組比較，c P ＜0．05;與依達拉奉組比較，e P ＜0．05

組別 例數(shù)腦組織水含量(%)*細胞凋亡性損傷細胞數(shù)(個)*Caspase-3 IR TUNEL 陽性腦出血組18 80．89±1．34 264．85±52．64 46．67±9．97阿加曲班組 18 77．86±1．21a 186．28±40．38a 29．33±7．83b依達拉奉組 18 78．04±1．06a 203．14±47．97a 33．63±7．60a阿加曲班聯(lián)合 18 76．04±0．92bce 154．76±38．56bce 21．86±9．3bce依達拉奉組

2.3 SOD活性及MDA含量 與腦出血組比較，阿加曲班組、依達拉奉組和阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組SOD活性均升高，MDA含量均降低，且阿加曲班聯(lián)合依達拉奉組SOD活性均高于阿加曲班組和依達拉奉組，MDA含量均低于阿加曲班組和依達拉奉組(P ＜0．05，P ＜0．01)，見表3。

表3 4組大鼠腦血腫周圍組織超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量(±s)

表3 4組大鼠腦血腫周圍組織超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量(±s)

注:*每組18只中6只用于超氧化物歧化酶活性以及丙二醛含量檢測;與腦出血組比較，a P ＜0．05，b P ＜0．01;與阿加曲班組比較，d P ＜0．01;與依達拉奉組比較，c P ＜0．05

組別 例數(shù) 超氧化物歧化酶活性(U/mg)*丙二醛含量(nmol/mg)*腦出血組18 202．43 ±43．15 69．68 ±9．43阿加曲班組 18 243．27 ±46．78a 57．54 ±7．68a依達拉奉組 18 273．14 ±67．45b 45．61 ±6．69b阿加曲班聯(lián)合 18 299．76 ±87．53bdc 39．82 ±4．97bdc依達拉奉組

3 討論

腦出血后產(chǎn)生大量凝血酶緩慢釋放到組織間隙，而其不僅與腦水腫、細胞凋亡性損傷有關(guān)，還能促進自由基的產(chǎn)生，對局部腦組織造成直接而嚴重的損傷［10］;另外凝血酶還可刺激小膠質(zhì)細胞的活化和增生，轉(zhuǎn)變?yōu)橥淌杉毎?，釋放腫瘤壞死因子-α、白介素-6(IL-6)、IL-12等炎性因子和一氧化氮(NO)［11］，從而促進自由基產(chǎn)生。另外，凝血酶的神經(jīng)毒性作用與凝血酶受體PAR-1的介導有關(guān)［12］，腦出血后自由基損傷與血紅蛋白分解產(chǎn)物及多種因素有關(guān)［1］，但其確切的信號轉(zhuǎn)導通路尚不清楚。阿加曲班具有以下優(yōu)點:①能與凝血酶活性中心可逆性結(jié)合;②僅抑制凝血酶的催化位點;③分子量小，不僅抑制游離的凝血酶，還能有效抑制與血凝塊結(jié)合的凝血酶，這種結(jié)合能力較水蛭素和低分子肝素高1000倍;④不影響纖溶酶活性，出血風險?。?3］。動物實驗研究提示，應用阿加曲班可減輕腦出血后的水腫及炎性損傷，而且沒有增加血腫的容積［3，14］。依達拉奉是捕獲自由基的活性抗氧化劑，有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化作用，抑制腦細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞的過氧化，減輕組織損傷和腦水腫［13，15］，可減輕腦出血后的自由基損害［5，7］。阿加曲班和抗自由基制劑聯(lián)合應用可更有效地抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣［2］。本研究結(jié)果顯示，腦出血模型制備成功后4組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，NDS比較差異無統(tǒng)計學意義;單用阿加曲班、依達拉奉均可明顯改善腦出血大鼠NDS，使腦組織水腫減輕，血腫周圍組織TUNEL陽性細胞、Caspase-3 IR細胞數(shù)減少，SOD活性升高，MDA含量降低，與以往研究結(jié)果一致［3，7，14，10，16-18］;阿加曲班與依達拉奉聯(lián)合應用上述指標改善更明顯，而且顯著優(yōu)于單用阿加曲班或依達拉奉組。提示單用抗凝血酶毒性或抗自由基治療雖然有效，但不能達到最佳效果，二者聯(lián)合應用不僅抑制了腦出血后的自由基損傷，還可以減輕腦組織水腫，抑制腦出血后的細胞凋亡性損傷，可能是更好的治療腦出血的策略。

本研究尚存在一些不足，如反映腦出血神經(jīng)損傷情況的指標很多，本研究僅選取了幾個代表性的指標:NDS是反映神經(jīng)功能受損的綜合性指標;腦水腫、TUNEL陽性細胞、Caspase-3 IR細胞是反映腦出血繼發(fā)神經(jīng)損傷的主要指標;SOD是專門清除超氧陰離子()的特異性抗氧化酶，可有效阻斷由過量所引起的一系列氧自由基病理性反應加劇;MDA是過氧化脂質(zhì)氫鍵斷裂后的產(chǎn)物，通過測量MDA含量可以間接反映氧自由基水平。

阿加曲班和依達拉奉的用法、用量參考了他人以及筆者前期的研究［5，14，18-19］。特別是阿加曲班僅在腦出血12 h內(nèi)應用是因為已有研究證實＞12 h即使加大阿加曲班的劑量也不能抑制腦出血神經(jīng)損傷。理論上來說，作為抗凝劑，阿加曲班是否會導致腦出血血腫擴大是需要探討的問題，由于我們前期及他人的研究已經(jīng)證實，早期應用阿加曲班不會導致血腫擴大［14，19］，故在本研究中未進行探討。

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Effect of Intraperitoneal Combined Adm inistration of Argatroban and Edaravone on Neural Injuries in Ratswith Intracerebral Hemorrhage

ZHOU Zhong-hea，YANG Lua，LIWeia，LIFeng-penga，QU Fanga，HAN Ya-lingb，CHEN Hui-shenga(General Hospital of Shenyang Military Area Command，a．Department of Neurology，b．Department of Vasculocardiology，Shenyang 110840，China)

ObjectiveTo investigate the effect of intraperitoneal combined administration of Argatroban and Edaravone on neural injuries in ratswith intracerebralhemorrhage(ICH)．MethodsRatmodelswere established by using autologous blood injection．Themodels were divided into ICH group，Argatroban group，Edaravone group and Argatroban combined with Edaravone group(n=18 each)．In Argatroban group，Argatroban was administrated intraperitoneally at0 h and 12 h one time respectively after the operation;in Edaravone group，Edaravonewas intraperitoneally injected 1 time/12 h for3 daysafter the operation;in Argatroban combined with Edaravone group，Argatrobanwasadministrated intraperitoneally at0 h and 12 h one time respectively 12 h after the operation，and Edaravonewas injected intraperitoneally 1 time/12 h for 3 days;In ICH group，after the operation，physiological saline was injected intraperitoneally 1/12 h for 3 days．Neurological deficit scores(NDS)ofall ratswere detected after ICH modelswere established and before the rats were killed respectively．TUNEL positive cell numbers，Caspase-3 immunoreactivity(Caspase-3 IR)cell numbers，water content of brain tissues，superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content in perihematoma brain tissueswere detected．ResultsCompared with those in ICH group，in the other three groups before the ratswere killed，NDS，TUNEL positive cell numbers，Caspase-3 immunoreactivity cell numbers，water content of brain tissue and MDA contentwere significantly decreased，while the SOD activity was elevated．Preferable therapeutic effectwas achieved in Argatroban combined with Edravone group，compared with those in Argatroban and Edaravone groups(P ＜0．05，P ＜0．01)．ConclusionBoth Argatroban and Edaravone intraperitoneal administration can effectively alleviate the secondary injuries such as brain edema，apoptosis and free radical damages in ICH ratmodels．Preferable therapeutic effect can be achieved by intraperitoneal combined administration of Argatroban and Edaravone．

Intracerebral hemorrhage;Argatroban;Edaravone;Rat，Wistar

R-332;R743．34

A

2095-140X(2014)04-0001-04

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．04．001

遼寧省自然科學基金(2013020204);科技部重大新藥創(chuàng)制創(chuàng)新藥物研究開放技術(shù)平臺建設(shè)(2012ZX0903016-002);沈陽軍區(qū)總醫(yī)院科研課題基金(08Y-Q08)

110840沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(周中和、楊璐、李巍、李鳳鵬、曲方、陳會生)，心血管內(nèi)科(韓雅玲)

陳會生，E-mail:chszh@aliyun．com;韓雅玲，E-mail:hanyaling@263．net

2013-11-18 修回時間:2013-12-20)

·論著·