欒麗英，張振文,2，惠竹梅,2,*，房玉林,2，霍珊珊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

脫落酸處理對赤霞珠和煙73葡萄果皮花色苷組分的影響

欒麗英1，張振文1,2，惠竹梅1,2,*，房玉林1,2，霍珊珊1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

目的：比較赤霞珠和煙73葡萄果皮花色苷組分的差異，以及脫落酸（abscisic acid，ABA）處理提高果實著色前提下，對兩個品種果皮花色苷組分的影響。方法：以煙73和赤霞珠為試材，在著色前期用200 mg/L ABA處理果穗，對照用清水代替激素。成熟采收后，提取果皮中花色苷，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，對花色苷組分進(jìn)行定性和定量檢測，然后進(jìn)行比較分析。結(jié)果：對照中共檢測到16 種花色苷，其中煙73果皮花色苷組分檢測到15 種，含量為8 400.9 mg/kg，赤霞珠檢測到12 種，含量為1 131.9 mg/kg。ABA處理顯著提高了兩品種果皮花色苷總量：煙73提高至10 380.2 mg/kg，赤霞珠提高至1 470.2 mg/kg?；ㄉ崭鞔箢惪偭恳苍诓煌潭鹊玫教岣摺＝Y(jié)論：煙73和赤霞珠兩個不同葡萄品種間花色苷種類和含量存在顯著差異。ABA處理顯著提高了兩品種果皮花色苷總量，并且不同種類花色苷含量均在不同程度得到提高，從而促進(jìn)果實著色。

脫落酸；煙73；赤霞珠；花色苷；葡萄

花色素苷是一種水溶性黃酮類色素，是紅色、紫色和藍(lán)色果面色澤的主要構(gòu)成物，在特定條件下呈現(xiàn)黑色[1]。葡萄果皮花色苷不但含量高，而且種類多，葡萄花色苷作為一種天然食用色素，安全、無毒，且具有降低肝臟及血清中脂肪含量、抗氧化、防止動脈硬化、抗變異、抗腫瘤、抗過敏、保護(hù)胃黏膜、延遲血小板凝集等多種生理和藥用活性功能[2-4]。葡萄果實的顏色對釀酒和鮮食品種都有作用，果實著色好壞是影響其價格和市場競爭

力的重要因素，也是衡量果實品質(zhì)的重要指標(biāo)[5]。葡萄果實中的花色素苷在發(fā)酵過程進(jìn)入到葡萄酒中，使葡萄酒呈現(xiàn)鮮亮的色澤，顏色作為葡萄酒的第一感官品質(zhì)，在很大程度上影響著消費者的選擇心理和對 其他感官品質(zhì)的評價，并且花色苷對葡萄酒的質(zhì)量和營養(yǎng)價值的作用更大[6-8]。果實的著色 過程不僅受植物本身的遺傳因素調(diào)控，也受外部因素，如光照、溫度、植物生長調(diào)節(jié)劑等的影響[1,9]。目前很多研究指出，脫落酸（abscisic acid，ABA）能顯著促進(jìn)各種葡萄品種果實成熟和花色苷合成，提高果實含糖量以及花色苷總量[10-18]，但是鮮有研究具體指出ABA處理對葡萄中花色苷單體物質(zhì)的種類和含量等方面的影響。

本研究中選用了被廣泛栽培的釀酒品種赤霞珠和中國自主選育的紅色染色品種煙73，研究這兩個不同品種果皮花色苷物質(zhì)組分的區(qū)別，以及ABA處理對兩品種果皮花色苷物質(zhì)種類和含量的影響。旨在討論品種對花色苷組分的影響，以及外源激素ABA對兩個品種果皮花色苷物質(zhì)的組分和含量的影響，也為進(jìn)一步研究ABA調(diào)控花色苷合成機(jī)理提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗在陜西省咸陽市涇陽縣白王鎮(zhèn)釀酒葡萄基地進(jìn)行，供試品種為歐亞種釀酒葡萄赤霞珠（Cabernet Sauvignon）和我國自主選育的染色品種煙73，2006年定植，南北行向，株行距為0.8 m×2.5 m，單干雙臂整形，選擇樹勢中庸、掛果一致的植株，采用正常的田間管理。

500 mg（+）-ABA 美國Sanland公司；甲醇、甲酸、乙腈、乙酸（均為色譜純） 美國Fisher公司；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)樣 法國Extrasynthese SA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；5804R低溫冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；1100高效液相色譜-質(zhì)譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

選用植物生長調(diào)節(jié)劑200 mg/L ABA，以清水代替植物激素為對照（CK）。植物激素（或清水）用98%的乙醇溶解后稀釋到適宜質(zhì)量濃度，乙醇最終含量為0.1%（體積分?jǐn)?shù)），用吐溫-80作為展開劑，最終含量為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）。其中ABA處理質(zhì)量濃度是根據(jù)本課題組之前實驗研究結(jié)果[18]選定，該質(zhì)量濃度使果實總花色苷顯著提高。選取生長發(fā)育長勢一致的植株和果穗，每棵植株從不同方位選15～20穗長勢一致的果穗掛牌，轉(zhuǎn)色前期（2011年7月2日）分別對赤霞珠和煙73進(jìn)行噴施處理，激素溶液在掛牌果穗上均勻噴施，直至滴水為止。設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 株葡萄。

1.3.2 葡萄樣品的采集

于2011年7月2日處理前，采集各處理區(qū)樣品。以后約7 d采樣一次，測定葡萄的糖、酸，以及總花色苷，直至果實采收，赤霞珠葡萄采收期為8月31日；煙73葡萄采收期為8月16日。樣品采集時間為早晨8:00—10:00。采樣時各處理小區(qū)分別采樣，每個重復(fù)選一棵植株，從上中下不同方位采3～4 穗，共采9～10 穗，采后立即放入冰盒，帶回實驗室后，將每個重復(fù)的果穗剪成果粒并混合均勻。

1.3.3 葡萄果皮花色苷的提取

用鑷子將葡萄果皮剝離，然后準(zhǔn)確稱取0.5 g的葡萄果皮加入10 mL含2%甲酸-甲醇溶液，避光超聲提取10 min，然后在25 ℃的搖床中避光提取30 min，再以8 000 r/min轉(zhuǎn)速4 ℃條件下離心8 min，將上清液收集于100 mL圓底燒瓶中（避光），以上步驟重復(fù)4 次，將合并的上清液避光30 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，殘渣用流動相（V（流動相A）∶V（流動相B）=9∶1）轉(zhuǎn)移出來，定容至10 mL，-40 ℃條件下避光保存?zhèn)溆茫瑯悠愤M(jìn)樣前用0.45 μm慮膜過濾[19]。

1.3.4 花色苷組分的定性、定量分析

樣品的檢測工作在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)和營養(yǎng)工程學(xué)院葡萄與葡萄酒研究中心進(jìn)行，定性工作是在該研究中心建立的“葡萄與葡萄酒花色苷HPLC-UV-MS-MS指紋普庫”的基礎(chǔ)上，結(jié)合保留時間和文獻(xiàn)資料對樣品中的花色苷物質(zhì)進(jìn)行定性；定量方法是作二甲花翠素葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以其為外標(biāo)物進(jìn)行定量計算，所有檢測出的花色苷類物質(zhì)均以二甲花翠素葡萄糖苷的含量計[20]，高效液相色譜-質(zhì)譜分析條件參考He Jianguo[21]、程國利[22]等的研究。

高效液相色譜-質(zhì)譜條件：樣品經(jīng)過0.45 μm膜過濾后直接進(jìn)入Agilent 1100高效液相色譜-質(zhì)譜分析，每樣品重復(fù)3 次。色譜柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A相：水-甲酸-乙腈（92∶2∶6，V/V）；B相：水-甲酸-乙腈（44∶2∶54，V/V）。檢測波長：525 nm；樣品進(jìn)樣量：30 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：50 ℃。洗脫程序：0～4 min，6%～10% B；4～12 min，10%～25% B；12～13 min，25% B；13～20 min，25%～40% B；20～35 min，40%～60% B；35～40 min，60%～100% B；40～45 min，100%～6% B。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，負(fù)離子模式，離子掃描范圍：200～1500 m/z；霧化氣壓力：35 psi；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：350 ℃；Trap ICC：30 000 u；碰撞電壓1.00 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件和Excel進(jìn)行處理，差異顯著性分析采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠和煙73果皮花色苷比較

表1 ABA處理對煙73和赤霞珠果皮花色苷組分含量的影響Table 1 Effect of ABA treatment on anthocyanin contents of grape skins from Yan 73 and Cabernet Sauvignonmg/kg

花色苷是紅葡萄酒中極為重要的組分之一，它的組成特征與葡萄品種也有很大的關(guān)系。實驗中通過對赤霞珠和煙73葡萄果皮中花色苷的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，共檢測到16 種花色苷，結(jié)果見表1。其中，赤霞珠果皮中檢測到12 種花色苷（未檢測到花青素乙?；咸烟擒铡?-乙醛二甲花翠素葡萄糖苷、二甲花翠素咖啡?；咸烟擒蘸?-羥基-4-乙烯基苯酚二甲花翠素葡萄糖苷4 種），含量為1 131.9 mg/kg，煙73檢測到15 種花色苷，含量為8 400.9 mg/kg，也證實品種對花色苷組分和含量有極其顯著的影響。煙73是我國自主選育的染色品種，由檢測結(jié)果也可以看出，其果皮中花色苷含量是赤霞珠果皮中的7.4 倍，并且由表1可以看出，兩個品種檢測到的花色苷組分含量都有幾倍甚至10 倍以上的差異，因此在葡萄酒生產(chǎn)中煙73常作為染色品種對其他葡萄酒進(jìn)行調(diào)色[23]。

通過對兩個葡萄品種測定結(jié)果比較得到（圖1），赤霞珠和煙73果皮花色苷均含有二甲花翠素類（malvidin derivatives，Mv）、花翠素類（delphinidin derivatives，Dp）、甲基花翠素類（petunidin derivatives，Pt）、花青素類（cyanidin derivatives，Cy）和甲基花青素類（peonidin derivatives，Pn）5大類，其中所占比例最高的均為Mv，達(dá)到70%左右，其次是Pn，所占比例最少的是Cy，僅占1%左右?？梢奙v是赤霞珠和煙73葡萄中的主要花色苷聚集類型。并且在其他葡萄品種中Mv的比例也占有絕對優(yōu)勢，如西拉和黑比諾等，也說明這些品種參與此花色苷類生物合成的甲基轉(zhuǎn)移酶活性都很強[24]。果實在成熟過程中，Cy和Dp兩大類花色苷可以被轉(zhuǎn)化成其他更穩(wěn)定的形式[25]，因此，這兩大類花色苷所占比例一般比較低。

圖1 ABA處理對赤霞珠（A）和煙73（B）果皮5 大類花色苷含量的影響Fig.1 Effect of ABA treatment on the contents of five categories of anthocyanins in grape skins from Cabernet Sauvignon and Yan 73

根據(jù)花色苷的合成過程，可將葡萄果實中的花色苷分為兩種類型，分別為3’-取代花色苷和3’5’-取代花色苷：3’-取代花色苷的B環(huán)上3’-位被羥基或甲氧基取代，而5’-位沒有羥基或甲氧基取代；3’5’-取代花色苷的B環(huán)上3’和5’-位均被羥基或甲氧基取代。本研究中3’-取代花色苷包括花青素衍生物花色苷Cy和Pn兩大類，3’5’-取代花色苷包括花翠素衍生物花色苷Dp、Pt和Mv三大類。赤霞珠和煙73兩個品種果皮中3’-取代花色苷（Cy+Pn）占花色苷總量比例分別為12.77%和13.57%，煙73果皮中3’-取代花色苷所占比例略高于赤霞珠。并且，赤霞珠和煙73果皮花色苷中，B環(huán)甲基修飾的花色苷（Pn+Pt+Mv）所占比例分別為89.16%和92.33%，煙73果皮花色苷的甲基化程度略高于赤霞珠。說明煙73果皮中參與3’-取代花色苷合成和B環(huán)甲基修飾的關(guān)鍵酶的基因表達(dá)或者酶活性較赤霞珠果皮高。

赤霞珠和煙73兩個葡萄果皮中未?；王；问交ㄉ盏暮亢退急壤鐖D2所示。赤霞珠果

皮中僅含有未酰化、乙酰化和香豆?；? 類，而煙73果皮中還有咖啡?；推渌悾? 類。兩個品種中，未?；惢ㄉ蘸孔罡撸ǔ嘞贾橹袨?2.7%，煙73中為49.1%），這個跟Nú?ez等[26]在釀酒葡萄如赤霞珠、添帕尼優(yōu)（Tempranillo）和格拉西亞諾（Graciano）等果皮上得到的結(jié)果一致。其次是乙?；?。因此不同品種之間花色苷組分的?；绞讲煌?，但是未?；鸵阴；惖幕ㄉ諡橹饕M成。

2.2 ABA處理對赤霞珠和煙73果皮花色苷組分的影響

由表1可以看出，ABA處理顯著提高了兩個葡萄品種果皮花色苷的總量，分 別為赤霞珠提高至1 470.2 mg/kg（約1.3 倍），煙73提高至10 380.2 mg/kg（約1.2 倍），并且大部分花色苷組分含量都有不同程度的提高。說明ABA可以顯著促進(jìn)葡萄著色，提高果皮中花色苷的含量，這與周金梅[10]、趙權(quán)[11]等的研究結(jié)果一致。

如圖1所示，ABA處理后5 大類花色素苷的總量都得到顯著提高，但是所占比例的變化有所不同，其中Mv在兩個品種中所占比例均下降，Cy和Pn在兩個品種中所占比例均得到提高。并且，ABA處理使赤霞珠和煙73果皮B環(huán)甲基修飾的花色苷（ Pn+Pt+Mv）所占比例由對照組89.16%和92.33%，分別降低至86.38%和91.54%，使葡萄果皮花色苷甲基化程度有所降低。同時，ABA處理后3’-取代花色苷（Cy+Pn）所占比例，赤霞珠由12.77%提高至13.34%，煙73由13.57%提高至16.08%；反之3’5’-取代花色苷（Mv+Dp+Pt）在兩個品種中所占比例均減少。說明ABA處理對葡萄果皮中3’-取代花色苷合成的關(guān)鍵酶的基因表達(dá)或者酶活性的提高幅度大于對3’5’-取代花色苷的提高幅度。另外，ABA處理后Cy和Dp兩大類花色苷所占比例有所提高，而這兩類花色苷應(yīng)該轉(zhuǎn)化為其他更穩(wěn)定的形式存在，說明將Cy和Dp轉(zhuǎn)化為其他穩(wěn)定花色苷所需酶的活力相對較低[25]。

圖2 ABA處理對赤霞珠（A）和煙73（B）果皮不同結(jié)合形態(tài)花色苷含量的影響Fig.2 Effect of ABA on the contents of different anthocyanin derivatives in grape skins from Yan 73 and Cabernet Sauvignon

由圖2可以看出，ABA處理后，赤霞珠和煙73果皮不同結(jié)合形態(tài)花色苷的總量均有不同程度的提高，赤霞珠中3 大類總量均達(dá)到顯著性提高：未?；愄岣吡?7.7%（提高165.0 mg/kg），乙酰化提高了34.0%（提高138.2 mg/kg），香豆?；岣吡?7%（提高35.1 mg/kg）；而煙73五大類中只有未?；拖愣辊；瘍纱箢惪偭窟_(dá)到顯著提高：未?；岣吡?6.3%（提高1 086.5 mg/kg），香豆?；岣吡?8.0%（提高286.9 mg/kg）。但是處理對幾種分類所占比例的改變是不同的，對赤霞珠品種，3 大類中只有乙?；愃急壤兴岣?，由35.9%提高至37.1%；而煙73果皮則是未酰化類和香豆?；愃急壤兴岣撸謩e為未?；愑?9.1%提高至50.2%，香豆?；愑?2.2%提高至12.6%。因此ABA處理對不同品種中不同?；绞降淖饔眯Ч遣煌摹?/p>

3 結(jié) 論

煙73作為紅色染色品種，其果皮中花色苷的總量極顯著高于赤霞珠果皮，并且煙73果皮的花色苷物質(zhì)種類較赤霞珠果皮中多。同時，煙73果皮中3’-取代花色苷和B環(huán)甲基化修飾的花色苷所占比例均高于赤霞珠。ABA處理后，兩個葡萄品種的花色苷總量均得到顯著提高，各種單體花色苷的含量均在不同程度得到提高，對3’-取代花色苷的促進(jìn)程度大于對3’5’-取代花色苷的促進(jìn)程度，同時，使赤霞珠和煙73果皮B環(huán)甲基修飾的花色苷所占比例均有所降低。而ABA處理對不同品種中不同?；绞降淖饔眯Ч遣煌?，提高了赤霞珠中乙酰化類所占比例和煙73中未?；惡拖愣辊；愃急壤?/p>

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Effect of Abscisic Acid on Anthocyanin Composition of Grape Skins from Yan 73 and Cabernet Sauvignon

LUAN Li-ying1, ZHANG Zhen-wen1,2, XI Zhu-mei1,2,*, FANG Yu-lin1,2, HUO Shan-shan1
(1. College of Enology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

Objective: To evaluate the difference in the anthocyanin composition of grape skins from two cultivars, and the effects of abscisic acid (ABA) treatment used for enhancing color development in grape fruits on anthocyanins compounds of their skins. Methods: Yan 73 and Cabernet Sauvignon grapevines were used in this experiment. Two treatments, a control (water) and an application of 200 mg/L ABA, were applied on pre-veraison clusters. The anthocyanins in the skins of harvested fruits were extracted, and analyzed qualitatively and quantitatively by high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS). Results: A total of 16 anthocyanins were identified from the control skins, including 15 ones (8 400.9 mg/kg) in Yan 73 and 12 ones (1 131.9 mg/kg) in Cabernet Sauvignon. After ABA treatment, the anthocyanins contents of Yan 73 and Cabernet Sauvignon were distinctly enhanced to 10 380.2 and 1 470.2 mg/kg, respectively. All categories of anthocyanins were increased to different levels. Conclusions: The composition and contents of anthocyanins in grape skins were different between Yan 73 and Cabernet Sauvignon. The anthocyanin cont ents of the two cultivars were significantly increased by ABA treatment, and the contents of different anthocyanins categories were enhanced to different levels; as a result, fruit color development was promoted.

abscisic acid; Yan 73; Cabernet Sauvignon; anthocyanins; grape

S663.1

A

1002-6630（2014）18-0110-05

10.7506/spkx1002-6630-201418022

2013-12-26

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-30-zp-9）；陜西省自然科學(xué)基金項目（2011JM3004）

欒麗英（1982—），女，博士研究生，研究方向為葡萄與葡萄酒。E-mail：luanliying@163.com

*通信作者：惠竹梅（1969—），女，副教授，博士，研究方向為葡萄與葡萄酒。E-mail：xizhumei@nwsuaf.edu.cn