李 濤，劉曉璠，楊小蘭*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 0300 06）

啤酒花總黃酮測定方法的比較研究

李 濤，劉曉璠，楊小蘭*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 0300 06）

以高效液相色譜法對(duì)啤酒花總黃酮含量的測定結(jié)果作為評(píng)判標(biāo) 準(zhǔn)（相對(duì)準(zhǔn)確值），比較與評(píng)價(jià)AlCl3分光光度法、Al(NO3)3分光光度法和硼氫化鈉/氯醌分光光度法3 種 比色法測定 酒花總黃酮含量的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，高效液相色譜法測定酒花總黃酮含量為（12.73±0.26） mg/g；AlCl3法測得總黃酮含量為（13.66±0.45）mg/g，與高效液相色譜法偏差率為7.3%；而Al(NO3)3法測定結(jié)果為（43.53±1.16）mg/g，與高效液相色譜法的偏差率 為241.9%；硼氫化鈉/氯醌法測定結(jié)果為（70.25±1.42）mg/g，與高效液相色譜法的偏差率為451.8%。提出AlCl3分光光度法比其他2 種比色法更適用于酒花總黃酮含量的測定，該方法誤差小，準(zhǔn)確性好。

酒花；總黃酮；分光光度法；高效液相色譜法；黃腐酚

啤酒花（Humulus lupulus L.）為大麻科葎草屬多年生蔓性草本植物，簡稱酒花，是啤酒工業(yè)的原料[1]，它賦予啤酒特有的苦味與香味。酒花亦作為一種植物藥被國內(nèi)外廣泛使用[2]。近年來，啤酒花中黃酮類物質(zhì)逐漸受到人們的重視，研究表明，酒花黃酮具有抗病毒[3]、抗菌[4-5]、抗腫瘤[6]、抗氧化[7-8]等活性。

目前，總黃酮的測定方法主要有分光光度法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法。分光光度法主要有AlCl3分光光度法[9]、Al(NO3)3分光光度法[10]和硼氫化鈉/氯醌（sodium borohydride/chloranil，SBC）分光光度法[11]，其基本原理為黃酮類化合物進(jìn)行絡(luò)合顯色，通過標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照測定總黃酮的含量。分光光度法所用設(shè)備簡單，操作容易，廣泛用于植物總黃酮的測定，但該方法專一性差，由于一些酚類物質(zhì)的干擾使得測定結(jié)果偏高[12]。HPLC法具有分析速度快、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，該法可以通過相應(yīng)的對(duì)照品直接測定總黃酮含量，也可以通過水解后測定黃酮苷元含量，再通過轉(zhuǎn)化系數(shù)求得總黃酮含量，但該方法樣品前處理復(fù)雜，且儀器昂貴不能廣泛應(yīng)用[13]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法和AlCl3、Al(NO3)3和SBC 3種分光光度法對(duì)酒花總黃酮含量進(jìn)行測定，以HPLC法的測定結(jié)果作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)（相對(duì)準(zhǔn)確值），比較3種分光光度法測定結(jié)果的偏差率。目的是確定一種最適合于酒花黃酮測定的分光光度法，為酒花的開發(fā)利用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒花（青島大花） 新疆綠金啤酒花有限責(zé)任公司；

蘆丁（純度95%）、兒茶素（純度96.0%）、槲皮素（純度98%）、山奈酚（純度98%）、黃腐酚（純度98%）美國Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；其他藥品均為分析純 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（1525系列雙泵系統(tǒng)、2487雙波長紫外檢測器、Breeze軟件操作系統(tǒng)） 美國Waters公司；sp-2102UVpc紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒花總黃酮的提取

1.000 g粉碎酒花，用石油醚加熱回流60 min，除去色素及脂（酯）類[2]。過濾后將啤酒花中殘留石油醚揮干。加入50 mL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇30 ℃超聲提取1 h，離心后過濾分離得上清液，按上述條件重復(fù)提取1 h，將2 次上清液混合定容至100 mL作為酒花黃酮提取液。

1.3.2 HPLC法測定酒花總黃酮

1.3.2.1 鹽酸水解-HPLC法測酒花黃酮苷

樣品水解處理[14]：取酒花黃酮提取液10 mL，加10 mL甲醇，5 mL體積分?jǐn)?shù)25%鹽酸（以濃鹽酸為基準(zhǔn)）溶液，置水浴中80 ℃回流水解2 h后，迅速冷卻至室溫，全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量 瓶中，用甲醇稀釋至100 mL，作為水解樣品。將未水解樣品與水解樣品均用0.45 μm濾膜過濾，用HPLC進(jìn)行游離黃酮苷元和水解產(chǎn)生黃酮苷元的測定。采用0.008、0.016、0.032、0.048、0.064 μg/mL 5個(gè)梯度的槲皮素和山奈酚混標(biāo)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有測定均進(jìn)行5 次平行測定，結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

色譜條件[15]：Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測波長370 nm；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相組成及洗脫程序見表1。

表1 鹽酸水解-HPLC法測黃酮苷元梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient program for the analysis of flavonoid aglycone by hydrochloric acid hydrolysis-HPLC method

1.3.2.2 酒花中黃腐酚（xanthohumol，XN）含量的測定[16]

采用1.3.2.1節(jié)色譜條件，流動(dòng)相組成及洗脫程序見表2。采用2、4、8、16、24 μg/mL 5個(gè)梯度的XN標(biāo)準(zhǔn)品使用最小二乘方直線回歸法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)。所有測定均進(jìn)行5 次平行測定，結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表2 HPLC測XN梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradient program for XN analysis by HPLC method

1.3.3 分光光度法測定酒花總黃酮

1.3.3.1 AlCl3法[9]

精確吸取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.25、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和一定量的樣品酒花黃酮提取液分別置于10 mL試管中；加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL、1 mol/L乙酸鉀溶液3 mL，用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇定容至10 mL，室溫放置30 min，同時(shí)以體積分?jǐn)?shù)70%甲醇做空白對(duì)照，在波長420 nm處測吸光度[5]。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。以樣品的吸光度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮含量。進(jìn)行5 次平行測定，結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.3.2 Al(NO3)3法[10]

分別取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL和一定量的樣品酒花黃酮提取液置于7 只試管中，用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇補(bǔ)足體積到5 mL，后各加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液，混合后靜置5 min；再加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液，混合后靜置6 min；最后加入4 mL 1mol/L NaOH溶液，加入0.4 mL體積分?jǐn)?shù)30%甲醇使總體積為10 mL，混合后靜置10 min，在波長510 nm處測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。以樣品的吸光度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮含量。進(jìn)行5 次平行測定，結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.3.3 硼氫化鈉/氯錕法

按照He Xiangjiu等[11]的方法進(jìn)行，將一定量酒花黃酮提取液氮?dú)飧稍?，回收? mL四氫呋喃-乙醇溶液中作為樣品。以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，使用四氫呋喃-乙醇作為溶劑配制成不同質(zhì)量濃度酒花黃酮的樣品溶液。每1 mL樣品溶液或1 mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液的試管中加入0.5 mL 50 mmol/L NaBH4溶液和0.5 mL 74.56 mmol/L AlCl3溶液，室溫振蕩30 min，再追加0.5 mL NaBH4溶液到每個(gè)試管中，繼續(xù)在室溫條件下振蕩30 min，然后將冷乙酸溶液（4 ℃、2.0 mL、0.8 mol/L）加入到每個(gè)試管中，避光振蕩15 min后，再將1 mL 20 mmol/L氯醌添加到每個(gè)試管中，100 ℃水浴加熱60 min，反應(yīng)后迅速冷卻試管，并將最終體積用甲醇定容為4 mL。然后，每管加入1 mL 1 052 mmol/L香蘭素，混勻后加入12 mol/L鹽酸2 mL，避光反應(yīng)15 min。最終反應(yīng)液在波長490 nm處測量吸光度。以兒茶素標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線。以樣品的吸光度

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮含量。進(jìn)行5 次平行測定，結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法測定酒花總黃酮

2.1.1 鹽酸水解-HPLC法測定酒花黃酮苷含量

黃酮游離苷元在自然界中不穩(wěn)定而很難存在，因此，黃酮多以糖苷形式穩(wěn)定存在[17]。對(duì)照品HPLC色譜圖見圖1。本實(shí)驗(yàn)對(duì)未水解的酒花樣品中游離苷元進(jìn)行測定。結(jié)果表明，酒花中不含游離黃酮苷元，這與王鵬等[18]的研究結(jié)果相同。因此，采用經(jīng)水解的酒花樣品測得的苷元均為黃酮苷水解后所產(chǎn)生的苷元，其測定結(jié)果見圖2。圖2中峰1保留時(shí)間為5.21 min，與圖1對(duì)照品槲皮素保留時(shí)間（5.21 min）相同，可確定為槲皮素。圖2中峰2保留時(shí)間為8.41 min，與圖1對(duì)照品山奈酚保留時(shí)間（8.41 min）相同，可確定為山奈酚。測定結(jié)果顯示，酒花中僅含槲皮素和山奈酚2 種黃酮苷元，這與王仿等[19]的結(jié)果一致。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=3.75×106X-28 416.3（R2=0.998 8）。山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=8.47×106X-115 426.1（R2=0.992 6）。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得酒花黃酮提取物中槲皮素苷元（P1）的含量為（0.031 0±0.000 3）μg/mL，山奈酚苷元（P2）的含量為（0.012 7±0.000 6）μg/mL。

圖1 對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the reference

圖2 水解樣品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the hydrolyzed sample

1993年，Sticher首次提出通過轉(zhuǎn)換因子由黃酮苷元計(jì)算得到黃酮苷含量，山奈酚轉(zhuǎn)換因子為2.64，槲皮素轉(zhuǎn)換因子為2.51[20]。由公式（1）得到酒花中總黃酮苷含量為（11.134±0.234）mg/g。

式中：P1為水解液中槲皮素苷元含量（0.031 0×10-3mg/mL）；P2為水解液中山奈酚苷元含量（0.012 7×10-3mg/mL）；r1為槲皮素苷元轉(zhuǎn)換因子為2.51；r2為山奈酚苷元轉(zhuǎn)換因子為2.64；m酒花為酒花質(zhì)量/g；V提取液為提取溶液的體積/mL。

2.1.2 HPLC法測酒花中XN含量

HPLC法測得XN對(duì)照品保留時(shí)間為9.780 min（圖3），標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=61 829X+33.102，R2=0.998。酒花樣品的XN測定色譜圖見圖4，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酒花中XN含量為（1.300±0.025）mg/g。

圖3 XN標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of XN reference

圖4 酒花中XN HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of XN in hops

2.1.3 酒花總黃酮計(jì)算結(jié)果

先前的研究已表明，酒花中的黃酮類化合物主要是黃酮苷和異戊烯基類黃酮，而異戊烯基類黃酮的主要組成為XN，其含量占異戊烯基類黃酮的80%[21]。因此，由公式（2）得出酒花總黃酮含量為（12.73±0.26）mg/g。

2.2 3 種分光光度法測定結(jié)果的比較

本研究中，AlCl3分光光度法測得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.793 1x-0.000 5，R2=0.999 7；Al(NO3)3法測得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.196 2x+0.020 8，R2=0.995 8；SBC法測得兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.027 6x+0.125 4，R2=0.995 0。采用公式（3）計(jì)算3 種分光光度法與HPLC法相比的偏差率。

結(jié)果表明，A l C l3法測定的酒花總黃酮含量為（13.66±0.45）mg/g，與HPLC法相比偏差率為7.3%；A l(N O3)3法測定的酒花總黃酮含量為（43.53±1.16）mg/g，與HPLC法相比偏差率達(dá)241.9%；而SBC法測定的酒花總黃酮含量為（70.25±1.42）mg/g，與HPLC法相比有最大的偏差率為451.8%。結(jié)果表明，AlCl3法測定的總黃酮含量與Al(NO3)3法和SBC法相差甚遠(yuǎn)，從理論上分析，黃酮分子中的羰基與其鄰位羥基或2 個(gè)鄰二酚羥基均能與金屬離子Al3+配位，生成穩(wěn)定的5、6元環(huán)的有色絡(luò)合物[22]。但是，Al(NO3)3法是在堿性條件下，顯色反應(yīng)可以發(fā)生在非黃酮類多酚類化合物原兒茶素、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、綠原酸、羥基苯甲酸類等的鄰二酚羥基部位，導(dǎo)致黃酮測定結(jié)果偏高[23]。因此，Al(NO3)3法并非是測定黃酮類化合物專屬，而對(duì)多酚類物質(zhì)均有顯色反應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，酒花中含有4%～12%的多酚[24]，主要為原花青素、黃酮苷和異戊烯基黃酮[18]，其中原花青素占總多酚的50%以上[24]。酒花原花青素具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，可以與Al(NO3)3發(fā)生顯色反應(yīng)后在波長510 nm處有很強(qiáng)吸收，導(dǎo)致酒花總黃酮測定結(jié)果偏高。而AlCl3法的測定環(huán)境是酸性，在此條件下，只與黃酮分子中的羰基與其鄰位羥基之間反生顯色反應(yīng)，其顯色機(jī)理見圖5[23]。

圖5 lCl3法的顯色機(jī)理Fig.5 Mechanism of color development of aluminum chloride method

由此可見，AlCl3法可以避免鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的非黃酮類化合物的干擾，對(duì)黃酮類化合物的測定專屬性較強(qiáng)[25]。所以AlCl3法測定酒花總黃酮具有更好的專屬性，更高的準(zhǔn)確度。而SBC法中的四氫硼鈉反應(yīng)是鑒別二氫黃酮類化合物專屬性較高的反應(yīng)[11]，以兒茶素表示，用于測定酒花黃酮含量誤差較大。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸水解-HPLC法測定酒花黃酮苷元，通過轉(zhuǎn)換因子計(jì)算得到實(shí)際的黃酮苷含量，通過HPLC法測定酒花XN含量折算出異戊烯基類黃酮含量，二者之和為酒花總黃酮含量，所得結(jié)果更接近真實(shí)值。以此作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)AlCl3分光光度法、Al(NO3)3分光光度法和SBC分光光度法3 種比色法測定酒花總黃酮結(jié)果進(jìn)行了比較評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，AlCl3分光光度法比其他2 種比色法更適用于酒花總黃酮的測定。

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Comparative Study on Assays for Determination of Flavonoids in Hops (Humulus lupulus L.)

LI Tao, LIU Xiao-fan, YANG Xiao-lan*
(College of Life and Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

The accuracy of three spectrophotometric assays for the determination of flavonoids in hops (Humulus lupulus L.) using respectively AlCl3, Al(NO3)3and sodium borohydride/chloranil (SBC) was evaluated by comparison with the reference data (relatively more accurate) from HPLC analysis. The results showed tha t the total content of flavonoids in hops was (12.73 ± 0.26) mg/g by HPLC, compared to (13.66 ± 0.45) mg/g, (43.53 ± 1.16) mg/g, and (70.25 ± 1.42) mg/g with a relative deviation of 7.3%, 241.9% and 451.8%, respectively, as spectrophotometrically assayed using AlCl3, Al(NO3)3and SBC. Therefore, the AlCl3-based assay is proposed to be more suitable for the determination of flavonoids in hops with smaller errors.

Humulus lupulus L.; total flavonoids; colorimetric methods; high performance liquid chromatography (HPLC); xanthohumol (XN)

TS261.7

A

1002-6630（2014）18-0089-04

10.7506/spkx1002-6630-201418017

2013-11-27

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171748）；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20090321097）

李濤（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：1020486956@qq.com

*通信作者：楊小蘭（1956—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：1454552647@qq.com