胡海濤，王遠(yuǎn)興*，張 娟，鄧 靜

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 3300 47）

大粒車前子多糖酸水解產(chǎn)物的分析

胡海濤，王遠(yuǎn)興*，張 娟，鄧 靜

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 3300 47）

經(jīng)水提、醇沉、Sevag除蛋白后得到精制大粒車前子多糖（Plantago a siatica L. polysaccharide，PLP），采用0.3 mol/L三氟乙酸對(duì)PLP進(jìn)行部分酸水解。建立超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器技術(shù)篩選較優(yōu)水解條件的方法，同時(shí)運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法分析產(chǎn)物。結(jié)果表明：車前子多糖除蛋白后多糖 含量為68.56%。在水解溫度90 ℃、水解時(shí)間1.5 h條件下，能夠得到比較多的水解產(chǎn)物，經(jīng)超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析鑒定，水解產(chǎn)物中含有單糖、二糖至 低聚六糖，并且存在戊糖和己糖相互連接的片段，但并未發(fā)現(xiàn)多個(gè)己糖相互連接的片段。

大粒車前子；部分酸水解；超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用

車前子為車前科植物車前（Plantago asiati ca L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥成熟種子[1]，被我國(guó)衛(wèi)生部列為保健食品原料，也是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)用藥之一，具有清熱利尿、滲濕通淋、明目祛痰的功能[2]，車前子種皮外表細(xì)胞壁含有10%～30%黏液質(zhì)，是一種親水性膠體，屬多糖類物質(zhì)，是車前子中主要的有效成分，常被稱為車前子多糖或車前子膠[3]，據(jù)研究車前子多糖是一種部分發(fā)酵性膳食纖維，具有整腸通便[4]、降低血脂[5]、抗菌[6]等功能。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)產(chǎn)自江西吉安的大粒車前子多糖進(jìn)行了大量研究，例如，運(yùn)用二次響應(yīng)面法優(yōu)化了車前子多糖提取工藝，獲得最佳提取工藝條件[7]，建立了一種準(zhǔn)確測(cè)定車前子多糖的方法[8]，該多糖的主鏈?zhǔn)怯搔?1,4-木糖糖基相互連接，支鏈有β-末端-木糖糖基、α-末端-阿拉伯糖糖基、1,2,5-阿拉伯糖糖基、1,2-鼠李糖糖基等[9-10]，具有緩瀉[11]、抗氧化[12]、增強(qiáng)免疫[13-14]等功能。

多糖糖譜技術(shù)是將多糖進(jìn)行水解后，結(jié)合色譜分析技術(shù)來研究其內(nèi)部特征，Guan等[15]應(yīng)用該技術(shù)成功的將9種不同的傳統(tǒng)中藥分離開來，隨后又應(yīng)用到石斛[16]和蟲草[17]的研究當(dāng)中，將8個(gè)不同產(chǎn)地的石斛和12個(gè)樣本的蟲草有效的分離開來，同時(shí)Xie Jing[18]、Wu Dingtao[19]等采用酶解、部分酸水解的方式有效的辨別出了多產(chǎn)地的靈芝資源，該技術(shù)有助于多糖的質(zhì)量控制，然而車前子多糖在這方面卻未見詳細(xì)的報(bào)道。

車前子多糖主要是含有木糖和阿拉伯糖，糖環(huán)結(jié)構(gòu)分別為吡喃環(huán)和呋喃環(huán)形式[20]。一般而言，支鏈的糖苷鍵較主鏈糖苷鍵易于水解，呋喃糖較吡喃糖易于水解[21]。因此，本研究采用較低濃度的三氟乙酸水解車前子多糖溶液，結(jié)合超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（ultra performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector，UPLC-ELSD）以及超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）的方式解析多糖水解產(chǎn)物，旨在獲得更多水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)信息，為今后大粒車前子多糖糖譜的建立提供理論和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大粒車前子 產(chǎn)地江西吉安；三氟乙酸、無水乙醇、無水甲醇、正丁醇、三氯甲烷（均為分析純）、乙腈（色譜級(jí)） 美國(guó)Honeywell公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6538系列四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀、1290 UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)（配有蒸發(fā)光散射檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；ALPHA1-2型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ公司；TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；KQ3200E型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AL 104型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超純水儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取

稱取100 g車前子，加入12倍量的蒸餾水于100 ℃提取，離心過濾、收集濾液，重復(fù)1次，合并濾液后減壓濃縮至200 mL，加入乙醇至乙醇含量為80%（V/V），4 ℃靜置過夜，離心得沉淀。將沉淀用蒸餾水溶解后，再用Sevag法脫除游離蛋白質(zhì)，透析（自來水48 h，蒸餾水24 h），透析液真空濃縮后于4 ℃醇沉過夜，離心分離得到濾渣，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗2次，冷凍干燥得車前子精制多糖（Plantago asiatica L. polysaccharide，PLP）。

1.3.2 多糖含量的測(cè)定

以木糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，采用苯酚-硫酸法[22]測(cè)定車前子多糖含量。

1.3.3 對(duì)照品UPLC-ELSD分析

精密稱取葡萄糖、D-阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、蔗果三糖、水蘇糖、蔗果四糖、蔗果五糖9種標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水定容至10 mL的容量瓶中，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（葡萄糖0.9432 mg/mL、D-阿拉伯糖1.5648 mg/mL、蔗糖1.126 9 mg/mL、麥芽糖0.975 6 mg/mL、麥芽三糖1.429 6 mg/mL、水蘇糖0.581 2 mg/mL、蔗果三糖（GF2）1.136 5 mg/mL、蔗果四糖（GF3）1.082 3 mg/mL、蔗果五糖（GF4）0.843 6 mg/mL），并對(duì)色譜條件進(jìn)行選擇和優(yōu)化。

1.3.4 部分酸水解

稱取30.0 mg PLP，用0.3 mol/L三氟乙酸于90 ℃條件下分別水解1.5、2.5、3.5、4.5 h，無水甲醇旋蒸，超純水復(fù)溶，透析過夜，收集袋外液組分PLP-X（X代表不同水解時(shí)間），0.22 μm濾膜過濾，用于UPLC-ELSD和UPLCQ-TOF-MS分析。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Prevail Carbohydrate ES氨基色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：水（A）、乙腈（B）；梯度洗脫：0～15min，75% B；15～35min，75%～65% B；35～40min， 65%～75% B；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；ELSD的漂移管溫度40 ℃；霧化溫度45 ℃；載氣氮?dú)?；流?.3 L/min。

1.3.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；負(fù)離子檢測(cè)模式；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化氣壓力40 psi；毛細(xì)管出口電壓120 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～3 200。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量的測(cè)定

車前子多糖中木糖的含量較多，因此選用木糖標(biāo)準(zhǔn)品作其標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得車前子多糖總糖含量為68.56%。

2.2 標(biāo)照品的UPLC-ELSD分析及條件優(yōu)化

圖1 9種標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-ELSD色譜圖Fig.1 UPLC-ELSD chromatogram of nine saccharide standards

從圖1可以看出，單糖和雙糖全部在0～15 min分離開，三糖出現(xiàn)在15～20 min，四糖出現(xiàn)在20～28 min，五糖則在30 min左右出現(xiàn)。

霧化氣體流量和漂移管溫度是影響目標(biāo)峰響應(yīng)值的2個(gè)重要因素，氣體流量決定形成液滴的大小，漂移管溫度決定蒸發(fā)量的大小[23]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)氣體流量和溫度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)值并無明顯的變化和規(guī)律，通過調(diào)整兩者的設(shè)定值、觀察基線的響應(yīng)值、飄移值及信噪比變化情況，發(fā)現(xiàn)在當(dāng)漂移管溫度40 ℃、霧化溫度45 ℃、載氣流量1.3 L/min條件下，色譜圖基線平穩(wěn)，信噪比較小，滿足分析要求。

2.3 水解條件的優(yōu)化

圖2 不同酸水解時(shí)間時(shí)車前子多糖的UPLC-ELSD色譜圖Fig.2 UPLC-ELSD chromatograms of Plantago asiatica L. polysaccharide hydrolyzed for different periods of time

由圖2可知，在0～10 min之間，每張譜圖中都有2個(gè)比較明顯的色譜峰，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（圖1），該峰出現(xiàn)在單糖區(qū)域之內(nèi)，在戊糖和己糖的出峰位置，可知水解產(chǎn)物中有大量的單糖；隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖水解出的低聚糖逐漸減少；水解到2.5 h時(shí)，峰2、3、5、6、8消失；水解到3.5 h時(shí)，峰4、7消失；當(dāng)水解到4.5 h時(shí)，水解產(chǎn)物幾乎全部為單糖，可以得出隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解產(chǎn)物中的低聚糖逐漸裂解成單糖；當(dāng)多糖水解至1.5 h時(shí)，能夠水解出一系列的低聚糖，比較明顯產(chǎn)物如峰1、4、7，可能為二聚糖、四聚糖和五聚糖，峰2、3、5、6、8由于水解出的量較少，在色譜圖上并不是十分明顯。為了更加深入了解水解產(chǎn)物信息，將PLP-1.5進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS產(chǎn)物分析

采用上述質(zhì)譜條件對(duì)PLP-1.5進(jìn)行測(cè)定，所得總離子流圖如圖3所示，部分組分的質(zhì)譜圖見圖4，各物質(zhì)對(duì)應(yīng)的峰號(hào)、保留時(shí)間、主要碎片信息和水解產(chǎn)物見表1。

圖3 PLP-1.5的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of PLP-1.5

表 1 各水解產(chǎn)物的保留時(shí)間和主要離子碎片Table 1 Retention times and major ion fragments of hydrolysis products in a negative ion mode

如圖3和表1所示，車前子多糖水解后產(chǎn)生一系列的單糖和低聚糖，水解產(chǎn)物中戊糖和己糖所產(chǎn)生的離子碎片與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24]，戊二糖等其他低聚糖離子碎片為[M-H]-、[M＋Cl]-、[M＋COOH]-所結(jié)合的特征離子。單糖產(chǎn)物中戊糖比例很高，符合有關(guān)文獻(xiàn)[25]的報(bào)道；同時(shí)阿拉伯糖比木糖更易水解，推測(cè)戊糖中可能含有阿拉 伯糖和木糖；低聚糖多以戊糖與戊糖相連接，這與此前推測(cè)的一級(jí)結(jié)構(gòu)相符合[9-10]，可能是由阿拉伯糖糖基與木糖糖基相互連接在一起；m/z 311.100 7[MH]-、347[M＋Cl]-、357.106 7[M＋COOH]-表明1個(gè)戊糖和1個(gè)己糖相互連接并脫去1個(gè)H2O所形成的低聚二糖，表明多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在著這樣的重復(fù)片段，同時(shí)并未檢測(cè)出己糖相互連接所形成的碎片，推測(cè)在多糖支鏈上并不存在幾個(gè)己糖相互連接的片段。

圖4 不同保留時(shí)間色譜組分的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of different chromatographic fractions with various retention time

3 結(jié) 論

本研究建立了UPLC-ELSD法快速、準(zhǔn)確分離9種單糖及低聚糖標(biāo)品的方法，適用于多種單糖和低聚糖的檢測(cè)。運(yùn)用所建立的UPLC-ELSD方法對(duì)多糖水解條件進(jìn)行了篩選，采用0.3 mol/L三氟乙酸、水解溫度90 ℃、水解時(shí)間1.5 h條件，能夠得到較多的產(chǎn)物，為大粒車前子多糖糖譜的建立提供了方法支持。

采用超UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析水解產(chǎn)物，確定水解產(chǎn)物中有己糖、戊糖、戊二糖至低聚戊六糖，同時(shí)存在戊糖與己糖相互連接的片段，但并沒有發(fā)現(xiàn)己糖相互連接大分子片段。由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，仍需對(duì)產(chǎn)物做更進(jìn)一步的研究。

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Product Analysis of Plantago asiatica L. Polysaccharide by Acid Hydrolysis

HU Hai-tao, WANG Yuan-xing*, ZHANG Juan, DENG Jing
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Polysaccharides were isolated from seeds of Plantago asiatica L. by water extraction and ethanol precipitation, and subjected to protein removal by Sevag method, and then t he polysaccharide sample was hydrolyzed with 0.3 mol/L TFA by partial acid hydrolysis for different durations. An ultra performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection (UPLC-ELSD) method was established for establishing better hydrolysis conditions, and ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) was used for product analysis of samples under the optimal hydrolysis conditions. Results showed that the content of polysaccharides in the deproteinized sample was 68.56%. The optimal hydrolysis conditions were found to be hydrolysis with 0.3 mol/L TFA at 90 ℃ for 1.5 h. The hydrolysate obtained under these conditions contained more degradation products like monosaccharides and oligosaccharides, as identified by UPLC-Q-TOF-MS. Simultaneously, some pentose and hexose interconnected pieces in branch chains were also detected. However, multiple hexose connected pieces were not observed.

Plantago asiatica L.; partial acid hydrolysis; ultra performance liquid chromatography-evaporative lightscattering detector; ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry

TS207.3

A

1002-6630（2014）06-0060-05

10.7506/spkx1002-6630-201406012

2013-06-28

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31160321）

胡海濤（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析技術(shù)。E-mail：153708927@qq.com

*通信作者：王遠(yuǎn)興（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生、食品化學(xué)。E-mail：yuanxingwang@ncu.edu.cn