吳江渝，黃維哲，周 婷，何紫瑩

(武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

21世紀(jì)以來，世界癌癥的發(fā)病率一直呈逐年上升之勢，已經(jīng)成為威脅人類健康的頭號殺手.上世紀(jì)末出現(xiàn)基因治療技術(shù)，將很有可能成為人類21世紀(jì)攻克癌癥的有力工具[1].在基因治療中，安全而有效的基因載體系統(tǒng)是保障外源基因在目的細(xì)胞中高效、穩(wěn)定的表達(dá)以及成功開展基因治療的重要基礎(chǔ).樹形分子作為一種非病毒基因及藥物載體，具有良好的水溶性、生物相容性和低免疫原性，因而廣泛用于基因轉(zhuǎn)染和藥物輸送研究.由于與傳統(tǒng)大分子的聚合反應(yīng)不同，樹形分子一般通過逐步合成得到，因此其分子大小、形狀和表面官能團(tuán)數(shù)目可以得到精確控制[2-6].

聚酰胺胺(polyamidoamine，PAMAM)樹形分子是研究最早，應(yīng)用最廣泛的樹形分子類別，傳統(tǒng)的聚酰胺胺樹形分子以乙二胺或氨為核，通過反復(fù)的邁克爾加成反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)得到[7-9].研究表明，樹形分子的柔順性及表面官能團(tuán)密度會影響其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域如基因轉(zhuǎn)染和藥物傳遞方面的生物活性及細(xì)胞毒性[10].通過選擇不同的核單元結(jié)構(gòu)，可以有效控制聚酰胺胺樹形分子的核單元大小，從而調(diào)節(jié)分子的結(jié)構(gòu)柔順性及其表面官能團(tuán)密度.

本文以三(2-氨基乙基)胺(tri(2-aminoethyl)amine，TAEA)為核，通過發(fā)散法利用交替的邁克爾加成和酰胺化反應(yīng)合成第一代到第四代的酯基末端及氨基末端聚酰胺胺樹形分子，并通過紅外光譜和核磁波譜氫譜對所合成的樹形分子化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征.與傳統(tǒng)的氨核樹形分子以及本實(shí)驗(yàn)室前期工作合成的樹形分子化合物相比[11-12]，三(2-氨基乙基)胺結(jié)構(gòu)的引入使得所合成的聚酰胺胺樹形分子核單元更小，分子結(jié)構(gòu)更為緊密.因此，在相同代數(shù)情況下，該系列樹形分子具有較高的表面官能團(tuán)密度，以及較低的分子柔順性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

試劑：三(2-氨基乙基)胺，乙二胺(國藥集團(tuán)生產(chǎn)，化學(xué)純，使用前重蒸)，丙烯酸甲酯(國藥集團(tuán)生產(chǎn)，化學(xué)純，使用前重蒸)，甲醇(國藥集團(tuán)生產(chǎn)，化學(xué)純，使用前重蒸)，二氯甲烷(國藥集團(tuán)生產(chǎn)，化學(xué)純)，乙酸乙酯(國藥集團(tuán)生產(chǎn)，化學(xué)純)，石油醚(國藥集團(tuán)生產(chǎn)，化學(xué)純)，無水乙醚(國藥集團(tuán)生產(chǎn)，化學(xué)純)，薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠，試劑級)，石英砂(天津市南開化工廠，分析純)，柱層層析硅膠(青島海洋化工廠，試劑級).

儀器：85-2型恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海市嘉鵬科技有限公司)，JA3003N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠)，循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，2XZ-4型旋片式真空泵(臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司)，Nicolet6700型傅里葉紅外光譜儀(美國Thermo Electron公司)，Agilent 400MR型核磁共振波譜儀(美國Agilent公司).

1.2 合成方法

以三(2-氨基乙基)胺為出發(fā)點(diǎn)，通過與過量的丙烯酸甲酯反應(yīng)得到末端為酯基的0.5代聚酰胺胺樹形分子G0.5-PAMAM.G0.5-PAMAM樹形分子再與過量的乙二胺反應(yīng)，得到末端為氨基的1代樹形分子G1.0-PAMAM.重復(fù)以上步驟，可分別得到酯基末端的G1.5-PAMAM、G2.5-PAMAM、G3.5-PAMAM以及氨基末端的G2.0-PAMAM、G3.0-PAMAM、G4.0-PAMAM樹形分子.由于丙烯酸甲酯和乙二胺化學(xué)性質(zhì)活潑，本實(shí)驗(yàn)可在常溫下進(jìn)行，無需升溫處理.合成路線如圖1所示.

圖1 三(2-氨基乙基)胺核聚酰胺胺樹形分子的合成Fig.1 Synthesis of PAMAM dendrimers with TEAE core

具體合成步驟如下：

a.G0.5-PAMAM樹形分子的合成：

將過量的新蒸丙烯酸甲酯溶于10 mL甲醇中，攪拌狀態(tài)下向其中滴加適量的三(2-氨基乙基)胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的狀態(tài)下避光反應(yīng)36 h.采用甲醇作展開劑，經(jīng)薄層層析色譜(TLC)檢驗(yàn)證明三(2-氨基乙基)胺已反應(yīng)完全.停止反應(yīng)，旋蒸除去溶劑甲醇及過量的丙烯酸甲酯，得到淡黃色黏稠狀粗產(chǎn)物.采用甲醇∶二氯甲烷=1∶20(體積比)作淋洗劑，通過柱層析分離提純得到淡黃色黏稠狀液體G0.5-PAMAM，產(chǎn)率為75%.

b.G1.0-PAMAM樹形分子的合成：

將過量的新蒸乙二胺溶于12 mL甲醇中，攪拌狀態(tài)下向其中滴加適量的G0.5-PAMAM，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的狀態(tài)下反應(yīng)24 h.采用甲醇∶二氯甲烷=1∶20(體積比)作展開劑，經(jīng)TLC檢驗(yàn)和紅外光譜分析證明G0.5-PAMAM已反應(yīng)完全.停止反應(yīng)，旋蒸除去溶劑甲醇及大部分過量的乙二胺，得到淡黃色黏稠狀粗產(chǎn)物.將粗產(chǎn)物溶于少量甲醇，250 mL乙醚反復(fù)沉降3次，油泵減壓抽除殘余的乙二胺，直至TLC檢驗(yàn)無乙二胺為止，得到淡黃色黏稠狀液體G1.0-PAMAM，產(chǎn)率為92%.

c.G1.5-PAMAM樹形分子的合成：

將過量的新蒸丙烯酸甲酯溶于15 mL甲醇中，攪拌狀態(tài)下向其中滴加適量的G1.0-PAMAM，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的狀態(tài)下避光反應(yīng)36 h.采用甲醇作展開劑，經(jīng)TLC檢驗(yàn)證明G1.0-PAMAM已反應(yīng)完全.停止反應(yīng)，旋蒸除去溶劑甲醇及過量的丙烯酸甲酯，得到淡黃色黏稠狀粗產(chǎn)物.采用甲醇∶二氯甲烷=10∶1(體積比)作淋洗劑，通過柱層析分離提純得到淡黃色黏稠狀液體G1.5-PAMAM，產(chǎn)率為76%.

d.G2.0-PAMAM樹形分子的合成：

將過量的新蒸乙二胺溶于15 mL甲醇中，攪拌狀態(tài)下向其中滴加適量的G1.5-PAMAM，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的狀態(tài)下反應(yīng)24 h.采用甲醇作展開劑，經(jīng)TLC檢驗(yàn)和紅外光譜分析證明G1.5-PAMAM已反應(yīng)完全.停止反應(yīng)，旋蒸除去溶劑甲醇及大部分過量的乙二胺，得到淡黃色黏稠狀粗產(chǎn)物.將粗產(chǎn)物溶于少量甲醇，250 mL乙醚反復(fù)沉降3次，油泵減壓抽除殘余的乙二胺，直至TLC檢驗(yàn)無乙二胺為止，得到淡黃色黏稠狀液體G2.0-PAMAM，產(chǎn)率為95%.

重復(fù)以上步驟，即得到G2.5-PAMAM至G4.0-PAMAM各代樹形分子.

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外表征(IR)

本實(shí)驗(yàn)所用的產(chǎn)品均為液態(tài)，紅外光譜的測定采用涂膜法.圖2為酯基末端樹形分子的紅外光譜圖，圖3為氨基末端樹形分子的紅外光譜圖.

圖2 酯基末端樹形分子的紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of ester-terminating PAMAM dendrimers

圖3 氨基末端樹形分子的紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of amino-terminating PAMAM dendrimers

由圖可知，在3 300～3 500 cm-1處出現(xiàn)的峰為N-H的伸縮振動吸收峰，在2 943 cm-1附近出現(xiàn)的為亞甲基的C-H伸縮吸收峰，1 440 cm-1附近的峰為亞甲基的C-H的彎曲振動吸收峰.1 560 cm-1附近為酰胺羰基的N-H和C-N的彎曲振動吸收峰，1 650 cm-1附近為酰胺羰基中-CO-的伸縮振動吸收峰，兩個連續(xù)的吸收峰能證明分子中含有-CONH-結(jié)構(gòu).酯基末端樹形分子和氨基末端樹形分子最明顯的區(qū)別在于1 730 cm-1附近的酯羰基伸縮振動的特征吸收峰.對于G0.5-PAMAM，G1.5-PAMAM，G2.5-PAMAM，G3.5-PAMAM，由于其末端基團(tuán)為酯基，因此其在1 730 cm-1附近的酯羰基伸縮振動吸收峰能明顯觀察到(見圖2).對于G1.0-PAMAM，G2.0-PAMAM，G3.0-PAMAM，G4.0-PAMAM，由于其末端基團(tuán)為氨基，結(jié)構(gòu)中不存在酯基，因此其在1 730 cm-1附近不存在吸收峰(見圖3).通過觀察酯羰基伸縮振動吸收峰的出現(xiàn)和消失，可驗(yàn)證酯基是否與胺基完全反應(yīng).這些特征峰的存在能定性地表征化合物中特征集團(tuán)的存在，同時能進(jìn)一步反映反應(yīng)的進(jìn)程和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu).

2.2 核磁表征(1H-NMR)

為進(jìn)一步證實(shí)目標(biāo)產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，我們對所合成的各代樹形分子化合物進(jìn)行了核磁共振氫譜表征.對于酯基末端的樹形分子，所用核磁溶劑為CDCl3；對于氨基末端的樹形分子，所用核磁溶劑為D2O.由于分子中不同化學(xué)環(huán)境的氫原子能在核磁共振氫譜中表現(xiàn)出不同的化學(xué)位移，因此通過觀察核磁譜圖中氫原子共振吸收峰的化學(xué)位移及吸收峰面積，可以推斷所合成化合物的分子結(jié)構(gòu).

對于G0.5-PAMAM(圖4)，測試數(shù)據(jù)如下，1H-NMR(CDCl3)δ∶3.67 (18H, OCH3)，2.75(12H, NCH2CH2COO)，2.51(12H, NCH2CH2N)，2.46(12H, NCH2CH2COO).根據(jù)化學(xué)位移將其氫原子劃分為3類(化學(xué)位移分別在3.6～3.8，2.7～2.9，2.4～2.6之間的吸收峰對應(yīng)不同種類的氫原子)，3種氫原子的個數(shù)比為3∶2∶4，其對應(yīng)的吸收峰的積分面積之比約為24.5∶16.7∶32.4，這與氫原子的個數(shù)比吻合，故證明所得產(chǎn)物為純凈的G0.5-PAMAM.

圖4 G0.5-PAMAM樹形分子核磁共振氫譜Fig.4 1H-NMR spectrum of G0.5-PAMAM dendrimer

對于G1.0-PAMAM(圖5)，測試數(shù)據(jù)如下，1H-NMR(D2O)δ∶3.12 (12H, CONHCH2CH2CH3),2.70(12H, CONHCH2CH2CH3),2.64(12H, NCH2CH2CO),2.46(12H, NCH2CH2N)，2.27(12H, NCH2CH2CO).根據(jù)化學(xué)位移將其氫原子劃分為4類(化學(xué)位移分別在在3.0～3.25，2.55～2.8，2.4～2.55，2.2～2.35的吸收峰對應(yīng)的不同種類的氫原子)，4種氫原子的個數(shù)比為1∶2∶1∶1，其對應(yīng)的吸收峰的積分面積之比約為1.09∶1.98∶0.98∶1.00，這與氫原子的個數(shù)比基本吻合，故證明所得產(chǎn)物為純凈的G1.0-PAMAM.

對于G1.5-PAMAM(圖6)，與G0.5-PAMAM類似，根據(jù)化學(xué)位移將其氫原子劃分為3類(化學(xué)位移分別在在3.50～4.00，3.50～3.00，3.00～2.40的吸收峰對應(yīng)的不同種類的氫原子)，3種氫原子的個數(shù)比為3∶1∶8，其對應(yīng)的吸收峰的積分面積之比約為5.88∶2.34∶17.04，這與氫原子的個數(shù)比基本吻合，故證明所得產(chǎn)物為純凈的G1.5-PAMAM.

圖5 G1.0-PAMAM樹形分子核磁共振氫譜Fig.5 1H-NMR spectrum of G1.0-PAMAM dendrimer

圖6 G1.0-PAMAM和G1.5-PAMAM樹形分子核磁共振氫譜Fig.6 1H-NMR spectra of G1.5-PAMAM and G2.0-PAMAM dendrimers

對于G2.0-PAMAM(圖6)，與G1.0-PAMAM類似，根據(jù)化學(xué)位移將其氫原子劃分為3類(化學(xué)位移分別在在3.30～3.46，2.4～3，2.20的吸收峰對應(yīng)的不同種類的氫原子)，3種氫原子的個數(shù)比為3∶7∶3，其對應(yīng)的吸收峰的積分面積之比約為11.3∶27.5∶11，這與氫原子的個數(shù)比基本吻合，故證明所得產(chǎn)物為純凈的G2-PAMAM.

所合成的其它代數(shù)化合物，即G2.5-PAMAM，G3.0-PAMAM，G3.5-PAMAM，G4.0-PAMAM樹形分子的核磁共振氫譜如圖7所示，與前文討論類似，通過吸收峰的化學(xué)位移和積分面積分析，均能證明所得產(chǎn)物即為目標(biāo)樹形分子.

圖7 G2.5-PAMAM、G3.0-PAMAM、G3.5-PAMAM、G4.0-PAMAM的核磁共振氫譜Fig.7 1H-NMR spectra of G2.5-PAMAM,G3.0-PAMAM,G3.5-PAMAM and G4.0-PAMAM dendrimers

3 結(jié) 語

聚酰胺胺樹形分子作為一種潛在的基因及藥物載體材料而廣泛用于基因治療研究，其生物活性和細(xì)胞毒性與其分子的結(jié)構(gòu)柔順性和表面官能團(tuán)密度密切相關(guān).本文以三(2-氨基乙基)胺為核出發(fā)，采用交替的邁克爾加成反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)合成得到從0.5代到4代酯基末端和氨基末端的樹形分子，并通過紅外光譜和核磁共振氫譜分析證實(shí)了目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu).與傳統(tǒng)的氨核以及本實(shí)驗(yàn)室合成的其他聚酰胺胺樹形分子相比，該系列聚酰胺胺樹形分子的核單元更緊湊，從而使分子的柔順性降低，表面官能團(tuán)密度增大.其結(jié)構(gòu)上的改變能影響樹形分子在基因轉(zhuǎn)染和藥物傳遞中的生物活性，對安全高效的樹形分子載體試劑開發(fā)具有重要意義.

致 謝

本研究得到國家自然科學(xué)基金委員會提供的資金資助，特表感謝！

[1] MILLER A D.Human gene therapy comes of age[J].Nature,1992,357(6378):455-460.

[2] MAJOROS I J,THOMAS T P,MEHTA C B,et al.Poly(ami-doamine) dendrimer-based multifunctional engineered nanodevice for cancer therapy[J].Journal of Medicinal Chemistry,2005,48(19):5892-5899.

[3] MAJOROS I J,MYC A,THOMAS T,et al.PAMAM dendrimer-based multifunctional conjugate for cancer therapy:synthesis,characterization,and functionality[J].Biomacromolecules,2006,7(2):572-579.

[4] ZHU S,HONG M,ZHANG L,et al.PEGylated PAMAM dendrimer-doxorubicin conjugates:in vitro evaluation and in vivo tumor accumulation[J].Pharmaceutical Research,2010,27(1):161-174.

[5] SHI X,WANG S H,SHEN M,et al.Multifunctional dendrimer-modified multiwalled carbon nanotubes:synthesis,characterization,and in vitro cancer cell targeting and imaging[J].Biomacromolecules,2009,10(7):1744-1750.

[6] ZHANG Y,SUN Y,XU X,et al.Synthesis,biodistribution,and microsingle photon emission computed tomography (SPECT) imaging study of technetium-99m labeled PEG ylated dendrimer poly (amidoamine)(PAMAM)- folic acid conjugates[J].Journal of Medicinal Chemistry,2010,53(8):3262-3272.

[8] DYKES G M.Dendrimers:a review of their appeal and applications[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2001,76(9):903-918.

[9] IYYAMPERUMAL R,ZHANG L,HENKELMAN G,et al.Efficient electrocatalytic oxidation of formic acid using Au@ Pt dendrimer-encapsulated nanoparticles[J].Journal of the American Chemical Society,2013,135(15):5521-5524.

[10] LIU X X,WU J Y,YAMMINE M,et al.Structurally flexible triethanolamine core PAMAM dendrimers are effective nanovectors for DNA transfection in vitro and in vivo to the mouse thymus[J].Bioconjugate Chemistry,2011,22(12):2461-2473.

[11] WU J Y,ZHOU J H,QU F,et al.Polycationic dendrimers interact with RNA molecules:polyamine dendrimers inhibit the catalytic activity of Candida ribozymes[J].Chemical Communications,2005 (3):313-315.

[12] 吳江渝,徐美英,黃維哲,等.新型聚酰胺胺樹形分子的合成及表征[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報,2013,35(5):47-51.

WU Jiang-yu,XU Mei-ying,HUANG Wei-zhe,et al.Synthesis and characterization of new type of polyamidoamine dendrimer[J].Journal of Wuhan Institute of Technology,2013,35(5):47-51.(in Chinese)