楊宜非，劉亞瓊，曹婉寧

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

大孔樹脂富集發(fā)酵大豆提取物中乙酰膽堿酯酶抑制劑的工藝研究

楊宜非，劉亞瓊*，曹婉寧

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

為了確定適宜的大孔樹脂型號及富集乙酰膽堿酯酶抑制劑的最佳工藝條件，通過靜態(tài)吸附率和解吸液抑制率的測定，確定較優(yōu)樹脂型號，并考察動態(tài)解吸的相關(guān)影響因素。實驗結(jié)果表明：ADS-17為富集乙酰膽堿酯酶抑制劑的適宜樹脂，其靜態(tài)吸附率和解吸液抑制率分別可達(dá)96.65%、64.24%，其適宜富集工藝條件：靜態(tài)吸附飽和的樹脂用80%乙醇溶液進(jìn)行動態(tài)解吸，洗脫速度為1.0mL/min時，解吸液AChE抑制率為62.64%。

發(fā)酵大豆，大孔樹脂，乙酰膽堿酯酶抑制劑，富集

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s Disease，AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，據(jù)統(tǒng)計，2010年全世界AD患者達(dá)3560萬人[1]。目前，臨床上主要以乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）抑制劑作為其治療手段。發(fā)酵豆制品在我國及周邊國家有著悠久的加工和食用歷史。近年來，科學(xué)研究表明，發(fā)酵大豆不僅具有抗氧化[2]、降血壓[3]、降血糖[4]、溶血栓等作用，還具有抗老年癡呆的作用[5]，但發(fā)揮作用的生理活性物質(zhì)尚不明析。因此，探索發(fā)酵大豆中乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究對于拓寬發(fā)酵大豆制品的利用價值和范圍具有重要的理論意義和實用價值。

近年來，大孔吸附樹脂分離純化技術(shù)以其條件溫和、設(shè)備簡單、操作簡易等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的提取分離、中藥新藥的研發(fā)與生產(chǎn)中，諸如黃酮類、皂苷類、生物堿類等植物活性成分的分離純化[6-8]，中藥復(fù)方精制，生物化學(xué)物質(zhì)的凈化、分離，工業(yè)廢水、廢液的處理等方面。本文以大孔吸附樹脂為手段，考察其對發(fā)酵大豆中乙酰膽堿酯酶抑制劑的分離富集效果，為該抑制劑活性成分的純化及鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小黑豆 購于河北省保定市三豐糧油市場（2011年秋季收獲，吉林產(chǎn)），發(fā)酵后真空冷凍干燥，磨粉備用；大孔樹脂型號：D101、AB-8、HPD100、HPD417、HPD600、HPD750、HPD950、ADS-17、ADS-7、NKA-2

購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；乙酰膽堿酯酶、硫代乙酰膽堿碘化物、5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸（DTNB） Sigma-A ldrich；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

iMark酶標(biāo)儀 日本Bio-Rad Laboratories公司；MS-1微孔板振蕩器 Shimadzu，Japan；1.0cm×35cm玻璃層析柱 保定市明發(fā)生物科技有限公司；SHZ-82數(shù)顯恒溫恒速振蕩器 金壇市晶玻實驗儀器廠；BT100F智能型蠕動泵 保定雷弗流體科技有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理 將10種大孔樹脂分別用95%乙醇浸泡24h，使其充分溶脹后去除乙醇及漂浮物，再用95%乙醇反復(fù)沖洗至流出液加等量水不變白色渾濁為止，放掉乙醇液，用蒸餾水反復(fù)沖洗至濾液無醇味即可。各型號樹脂主要性能指標(biāo)見表1所示。

1.2.2 樣液的制備 小黑豆發(fā)酵凍干粉用80%乙醇超聲處理后減壓濃縮得浸膏，然后用乙酸乙酯萃取并減壓濃縮得樣品浸膏，加少量甲醇和水溶解作為上樣液。

1.2.3 乙酰膽堿酯酶抑制活性的測定 采用Ellman光度檢測法[9]并加以改進(jìn)。

抑制率（%）=（K陽性對照-K樣品）/（K陽性對照-K陰性對照）×100

1.2.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸液抑制率測定 分別準(zhǔn)確稱取0.5g預(yù)處理好的10種樹脂于碘量瓶中，各加入10m L濃度為0.5mg/m L的上樣液，室溫下置于振蕩器，速度為120r/m in，吸附24h，測定濾液對乙酰膽堿酯酶的抑制率。將抽濾后的樹脂放回碘量瓶中，加入80%的乙醇10m L，置于振蕩器上，速度保持120r/min，進(jìn)行24h靜態(tài)解吸，測定解吸液對乙酰膽堿酯酶的抑制率。

由于是未知物質(zhì)，因此不能用吸附量表示吸附能力的強弱，但通過測定吸附前后溶液對酶的抑制率可以比較不同樹脂對抑制劑的吸附強弱，吸附性越強相應(yīng)地吸附率越高；另外，通過測定解吸液對酶的抑制率可以表示物質(zhì)從大孔樹脂上解吸下來的情況，如果解吸抑制率越大，表明物質(zhì)解吸下來的越多，由于乙醇對該酶也有一定的抑制，因此需扣除解吸溶劑的影響，若采用解吸率（%）=I解/（I前-I后）×100考察不同樹脂的解吸情況，則對于吸附情況不好的樹脂，由于分母值較小，會產(chǎn)生解吸率偏大的情況，此外也不能扣除溶劑的影響。因此，按下式計算大孔樹脂的吸附率和解吸液抑制率：

吸附率（%）=（I前-I后）/I前×100

解吸液抑制率（%）=（I解-IE）×100

式中：I前為吸附前上樣液對乙酰膽堿酯酶的抑制率；I后為吸附24h后濾液對乙酰膽堿酯酶的抑制率；I解為解吸24h后濾液對乙酰膽堿酯酶的抑制率；IE為解吸所用乙醇溶液對乙酰膽堿酯酶的抑制率。

1.2.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線和靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線 稱取按1.2.4篩選到經(jīng)預(yù)處理的樹脂各2.5g于碘量瓶中，加入濃度為0.5mg/m L的上樣液50m L，置于振蕩器中，速度為120r/m in，測定不同吸附時間濾液對乙酰膽堿酯酶的抑制率，計算吸附率，并繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

將篩選到的樹脂按上述方法吸附飽和后用去離子水沖洗若干次，抽濾，然后分別加入50m L 80%乙醇溶液進(jìn)行解吸，測定解吸0.5、1、1.5、2、24h時解吸液對乙酰膽堿酯酶的抑制率，并繪制樹脂的靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線。

1.2.6 不同乙醇濃度洗脫對解吸液抑制率的影響 稱取按1.2.5篩選得到的經(jīng)預(yù)處理的樹脂5份各0.5g，加入濃度為0.5mg/m L的上樣液10m L，置于振蕩器中，速度為120r/m in，使其靜態(tài)吸附飽和，之后用去離子水沖洗若干次，抽濾，然后每份加入濃度分別為20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液各10m L進(jìn)行解吸洗脫。解吸24h后，測定各解吸液對乙酰膽堿酯酶的抑制率，確定適宜的乙醇洗脫濃度。

1.2.7 大孔樹脂動態(tài)梯度解吸對解吸液抑制率的影響 目的是考察動態(tài)洗脫時解吸液濃度對解吸效果的影響。稱取按1.2.5篩選得到的經(jīng)預(yù)處理的樹脂12.0g于1000m L大三角瓶中，加入濃度為0.5mg/m L的上樣液240m L，按上述方法進(jìn)行靜態(tài)吸附飽和，之后用去離子水沖洗若干次，抽濾，加入去離子水進(jìn)行濕法裝柱，用相當(dāng)于3倍柱體積的去離子過柱平衡后，用20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為0.5m L/min，每5m L收集一次流份，每個乙醇濃度的洗脫液收集8個流份，測定每個流份的乙酰膽堿酯酶抑制率，計算出解吸液的抑制率，繪制ADS-17樹脂的動態(tài)梯度解吸曲線。

1.2.8 大孔樹脂動態(tài)洗脫速度對解吸液抑制率的影響 稱取按1.2.5篩選得到的經(jīng)預(yù)處理的樹脂12.0g四份，分別置于1000m L大三角瓶中，加入濃度為0.5mg/m L的上樣液240m L，按上述方法進(jìn)行靜態(tài)吸附飽和，濕法裝柱并平衡后，先用20%乙醇溶液洗脫50m L，再用80%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，以去除極性成分并順利過渡到高濃度洗脫液，洗脫速度分別為0.3、0.5、1.0和1.5m L/m in，洗脫過程中每5m L收集一次流份，測定各流份的乙酰膽堿酯酶抑制率，計算出解吸液的抑制率，繪制ADS-17樹脂的動態(tài)洗脫曲線，確定適宜的洗脫速度。

表1 大孔樹脂的物理性能Table 1 Physical properties of 12macroporous resins

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件中的Duncan單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附率與解吸液抑制率

10種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附率與解吸液抑制率如表2所示。

表2 大孔樹脂吸附率與解吸液抑制率Table 2 The rate ofmacroporous resin’s adsorption and desorption fluid inhibition

由表2可知，D101、AB-8、ADS-17、ADS-7吸附率均在90%以上，明顯高于其他型號樹脂；但ADS-7樹脂的解吸液抑制率較低（＜50%），后續(xù)對D101、AB-8、ADS-17這三種樹脂進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

2.2 D101、AB-8、ADS-17大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線和靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線

三種大孔樹脂的靜態(tài)吸附速率曲線和靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線如圖1、圖2所示。由圖1可知，三種大孔樹脂的吸附率隨時間延長而增大，當(dāng)達(dá)到2.5h后趨于平緩。各樹脂吸附率相當(dāng)，AB-8在2.5h前吸附速率稍快，吸附24h時D101和ADS-17的吸附率均大于95%。

由圖2可知，在解吸0.5h之內(nèi)，三種樹脂基本解吸完畢，隨時間延長，D101和ADS-17大孔樹脂的解吸液抑制率基本不變，且ADS-17大孔樹脂的解吸液抑制率顯著高于其他兩種型號的樹脂（p＜0.05）。綜上所述，ADS-17大孔樹脂為富集發(fā)酵大豆中AChE抑制劑的適宜樹脂。

圖1 D101、AB-8和ADS-17樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.1 Static adsorption curves of D101，AB-8 and ADS-17

2.3 乙醇濃度對ADS-17大孔樹脂解吸液抑制率的影響

乙醇濃度對解吸液抑制率的影響如圖3所示，隨著乙醇濃度的增加，解吸液抑制率呈上升趨勢，當(dāng)乙醇濃度為80%時，ADS-17大孔樹脂的解吸液抑制率顯著高于其他乙醇濃度解吸液的抑制率（p＜0.05），因此，選擇80%乙醇溶液作為洗脫液。

圖3 乙醇濃度對解吸液抑制率的影響Fig.3 Effectof ethanol concentration on the rate ofdesorption fluid inhibition

2.4 ADS-17大孔樹脂梯度解吸對解吸液抑制率的影響

由圖4可知，動態(tài)解吸時，解吸液的抑制率隨著乙醇濃度的增加呈上升趨勢，當(dāng)乙醇濃度為20%～ 40%時（即解吸液體積≤80m L時），解吸液的抑制率較低，當(dāng)乙醇濃度為60%～80%時（即80m L＜解吸液體積≤160m L時），解吸液抑制率迅速上升，接近70%；當(dāng)乙醇濃度為95%時（即解吸液體積＞160m L時），解吸液抑制率呈下降趨勢。因此60%～80%乙醇溶液為較適宜的解吸液濃度。

2.5 ADS-17大孔樹脂動態(tài)解吸時不同洗脫流速對解吸液抑制率的影響

動態(tài)解吸時不同洗脫流速對解吸液抑制率的影響如圖5所示。隨著洗脫液流速的增加，解吸液抑制率呈增大趨勢，洗脫流速為1.0m L/min時，解吸液抑制率最高，當(dāng)洗脫流速為1.5m L/m in時，測得解吸液最大抑制率為51.93%。因此，動態(tài)解吸時洗脫液流速為1.0m L/m in時，洗脫效果較好，此時解吸液抑制率最高為62.64%。

圖4 ADS-17大孔樹脂動態(tài)梯度解吸對解吸液抑制率的影響Fig.4 Effectof differentethanol on the rate of desorption fluid inhibition in dynamic desorption of ADS-17macroporous resin

圖5 不同洗脫流速對解吸液抑制率的影響Fig.5 Effect of differentelution flow rate on the rate of desorption fluid inhibition in dynamic desorption analysis

3 結(jié)論

3.1 通過比較10種不同型號的大孔樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸液的抑制率，結(jié)合靜態(tài)吸附曲線和解吸曲線，ADS-17型大孔樹脂適用于發(fā)酵大豆乙酸乙酯萃取物中乙酰膽堿酯酶抑制劑的富集。當(dāng)對ADS-17型大孔樹脂靜態(tài)解吸時，選擇80%乙醇溶液作為洗脫液，其解吸液的抑制率較高，為64.24%。

3.2 利用ADS-17型大孔樹脂動態(tài)解吸時，當(dāng)洗脫液為80%乙醇溶液，洗脫速度為1.0m L/m in時，富集到的乙酰膽堿酯酶抑制劑濃度較高，此時洗脫液的AChE抑制率最大可達(dá)62.64%。

[1]World Alzheimer Report 2012：Overcoming the stigma of dementia[EB/OL].URL http：//www.alz.co.uk/research/World Alzheimer Report2 012.pdf.Accessed 10.07.13.

[2]Wang D，Wang L J，Zhu F X，et al.In vitro and in vivo studies on the antioxidant activities of the aqueous extracts of Douchi（a traditional Chinese salt-fermented soybean food）[J]. Food Chemistry，2008，107（4）：1421-1428.

[3]Zhang J H，Tatsumi E，Ding C H，et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides in douchi，a Chinese traditional fermented soybean product[J].Food Chemistry，2006，98（3）：551-557.

[4]Chen J，Cheng Y Q，Yamaki K，et al.Anti-α-glucosidase activity of Chinese traditionally fermented soybean（douchi）[J]. Food Chemistry，2007，103（4）：1091-1096.

[5]Liu Y Q，Wang L J，Cheng Y Q，et al.Isoflavone content and Anti-acetylcholin esterase activity in commercial douchi（a traditional Chinese salt-fermented soybean food）[J].Japan Agricultural Research Quarterly，2009，43（4）：301-307.

[6]徐清萍，何培新，朱廣存.大孔樹脂分離懷菊花黃酮的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（4）：103-106.

[7]熊春華，李大方，姚彩萍，等.大孔吸附樹脂吸附染料木素的研究[J].中國食品學(xué)報，2007，7（6）：71-76.

[8]李娜，魯曉翔.大孔吸附樹脂分離純化紅花總黃酮的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（4）：276-279.

[9]Ellman G L，Courteney K D，Valentino A J，et al.A new and rapid colorimeteric determination of acetylcholineesterase activity [J].Biochemical Pharmacology，1961，7（2）：88-90.

Study on enrichment of acetylcholinesterase inhibitor from fermented soybean w ith macroreticular resin

YANG Yi-fei，LIU Ya-qiong*，CAOW an-ning
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China）

To determ ine the app rop riate type of mac roporous resin and op timum conditions of enriching acetylcholinesterase inhibitors.Op timum type of resin was determ ined bymeasuring the rate of static adsorp tion and desorp tion fluid inhibition，and the dynam ic desorp tion’s related factors was stud ied.Results indicated that ADS-17 was the suitab le resin on enriching acetylcholinesterase inhibitors，and the rate of static adsorp tion and desorp tion fluid inhibition could reach 96.65%，64.24%.The op timum enrichment conditions were as follows：macroreticular resin by static adsorp tion saturation，elution solvent of 80%ethanol，elution rate of 1.0m L/m in. Under the mentioned conditions，the desorp tion fluid AChE inhibition rate reached 62.64%.

fermented soybean；macroreticular resin；acetylcholinesterase inhibitor；enrichment

TS214.9

B

1002-0306（2014）18-0232-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.042

2013－11－11 *通訊聯(lián)系人

楊宜非（1990-），男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31101336）。