霍丹群，馮 丹，周榮靈，宋興興，周 軍，，沈小娟，，沈才洪，侯長(zhǎng)軍，*

（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044；2.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000）

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化荷葉黃酮提取工藝及黃酮穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的探索

霍丹群1，馮 丹1，周榮靈1，宋興興1，周 軍1，2，沈小娟1，2，沈才洪2，侯長(zhǎng)軍1，*

（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044；2.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000）

以荷葉為原料，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型相結(jié)合的方法優(yōu)化超聲-滲漉協(xié)同作用浸提荷葉總黃酮的工藝條件并探討了影響荷葉黃酮穩(wěn)定性的因素。結(jié)果表明，優(yōu)化后的提取工藝為乙醇濃度60.2%，料液比1∶39.7g/mL，超聲時(shí)間80min，滲漉速度3mL/min，滲漉液收集體積為9.2倍，此條件下總黃酮得率為6.87%，與模型預(yù)測(cè)相對(duì)誤差僅為1.89%，表明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化荷葉黃酮提取工藝具有很好的可靠性和實(shí)用價(jià)值。荷葉黃酮提取液在低溫、微酸、避光條件下較穩(wěn)定，β-環(huán)糊精、VC、D-葡萄糖酸內(nèi)酯均對(duì)其均有一定的保護(hù)作用。

荷葉，黃酮，響應(yīng)面法，穩(wěn)定性

黃酮是自然界中的一大類(lèi)天然產(chǎn)物，具有很好的降血脂降血壓、抗氧化防衰老、防治心血管疾病、防治肝病等功效[1-3]，一直倍受人們重視，荷葉中因?yàn)楹胸S富的黃酮類(lèi)物質(zhì)，近年來(lái)關(guān)于荷葉黃酮的研究也頗多，但主要集中在黃酮的提取上，如何將黃酮得率盡可能地提高一直是研究的重點(diǎn)，而提取工藝條件的優(yōu)化則顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)因無(wú)法完全考察因素間交互作用的影響而得不到最優(yōu)的因素組合，現(xiàn)已不常使用；響應(yīng)面優(yōu)化法克服了此缺點(diǎn)，但它只適用于二次函數(shù)模型的模擬，在應(yīng)用范圍上有所限制[4]；而神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)沒(méi)有這些局限性，它是在模擬生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種數(shù)學(xué)模型算法[5]，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的不同可劃分為多種模型，其中BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)因具有良好的多因素多指標(biāo)的非線性關(guān)系分析能力、描述各因素與優(yōu)化指標(biāo)間內(nèi)在規(guī)律的能力及預(yù)測(cè)可信的全局最優(yōu)組合等能力，在優(yōu)化中藥材提取、控制食品加工等方面得到廣泛應(yīng)用[6-8]。黃萬(wàn)有等[9]利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化軍曹魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油的提取工藝，魚(yú)油提取率高至96.38%，取得較好的研究成果；吳淦洲等[10]利

用將BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用于沙姜總黃酮的提取中，總黃酮得率要比正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的得率提高了2.4%。因此本文采用超聲-滲漉協(xié)同法并神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化法對(duì)荷葉黃酮提取工藝進(jìn)行研究，為荷葉黃酮提供一種合理高效的提取方法。

此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荷葉黃酮浸提液在加工貯藏過(guò)程中極不穩(wěn)定，特別易受光、溫度等的影響而損失，使得荷葉原有保健功能降低，色澤褐變，影響荷葉產(chǎn)品的感官品質(zhì)。這與黃酮類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，黃酮是由帶酚羥基的苯環(huán)（A-、B-環(huán)）通過(guò)中央三碳原子連接而成的化合物，基本母核結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，其苯環(huán)鄰位酚羥基極其活潑易被氧化形成鄰醌，繼而發(fā)生聚合、縮合等反應(yīng)使浸提液受影響而變色，因此實(shí)驗(yàn)又探討了溫度、pH、光照、VC及食品添加劑對(duì)荷葉黃酮提取液穩(wěn)定性的影響，旨在為荷葉果汁產(chǎn)品質(zhì)量的提高提供科學(xué)依據(jù)及技術(shù)來(lái)源。

圖1 2-苯基色原酮Fig.1 2-color original ketone benzene

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉 重慶大學(xué)虎溪校區(qū)；蘆丁對(duì)照品 中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度98%；無(wú)水乙醇、硝酸鋁（A l（NO3）3）、亞硝酸鈉（NaNO2）、氫氧化鈉（NaOH）、β-環(huán)糊精、VC、D-葡萄糖酸內(nèi)酯 阿拉丁試劑有限公司，分析純；蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制。

鼓風(fēng)干燥機(jī)、粉碎機(jī) 杭州賽旭食品機(jī)械有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器上海）有限公司；AST-Q1024型超聲波清洗器 深圳市艾斯達(dá)工業(yè)自動(dòng)化有限公司；安捷倫Varian Cary50型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 安捷倫科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 荷葉總黃酮的提取 荷葉處理：低溫烘干，粉碎過(guò)20目篩備用。稱(chēng)取一定量荷葉干粉，加入一定量一定濃度的乙醇溶液，超聲一定時(shí)間，然后以一定速度滲漉一段時(shí)間，收集滲漉分離液，備用。

1.2.2 總黃酮含量的測(cè)定 采用NaNO2-A l（NO3）3-NaOH顯色法[11]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取0.5m L荷葉滲漉液，按此法顯色測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的得率，如下式所示：

Y（%）=C×a×V/W×100

其中，Y—總黃酮得率，%；C—由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出的總黃酮濃度，mg/m L；a—稀釋倍數(shù)；V—滲漉液體積，m L；W—荷葉干粉質(zhì)量，mg。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)以乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、滲漉速度和滲漉收集液體積為考察因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別考察這5個(gè)因素對(duì)荷葉黃酮提取得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[12-13]，以荷葉黃酮得率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，各因子編碼值見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels in the response surface design

1.2.5 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由輸入層、隱含層和輸出層組成，以影響因素為輸入層[14]，優(yōu)化指標(biāo)為輸出層，則輸入層節(jié)點(diǎn)數(shù)為3，輸出層節(jié)點(diǎn)數(shù)為1；隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)的選擇將影響網(wǎng)絡(luò)模型的性能，隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)過(guò)多則擬合過(guò)度，過(guò)少則擬合不足，其確定要不斷訓(xùn)練以滿足模型精度來(lái)決定，而模型精度即均方誤差（mse），常用來(lái)判斷所建神經(jīng)模型的合適與否。本實(shí)驗(yàn)是以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的17組數(shù)據(jù)為訓(xùn)練樣本，利用Matlab 7.0軟件構(gòu)建出BP預(yù)測(cè)模型[15-19]，模型建立后改變隱含層數(shù)、隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)來(lái)比較不同情況下均方誤差值的大小，從而確定BP網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

1.2.6 荷葉總黃酮的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 測(cè)定不同溫度、pH、光照、β-環(huán)糊精、VC和D-葡萄糖酸內(nèi)酯條件下荷葉黃酮在515nm處吸光度的變化，觀察測(cè)定各因素對(duì)黃酮類(lèi)化合物的穩(wěn)定性影響。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面優(yōu)化采用Design-Expert軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，該軟件有一模塊專(zhuān)門(mén)針對(duì)響應(yīng)曲面法，優(yōu)化分析結(jié)果可直接給出，非常方便。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析則使用Matlab神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱，由MathWork公司開(kāi)發(fā)的數(shù)學(xué)軟件，主要用于BP網(wǎng)絡(luò)分析與設(shè)計(jì)。此外為進(jìn)一步保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，每次實(shí)驗(yàn)均采用三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值進(jìn)行分析計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard absorption curve of rutin

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，不同濃度蘆丁溶液吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2，回歸方程為Y=25.050X-0.0026（R2=0.9996）。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取得率的影響 分別在一定量荷葉粉末中加入濃度為50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%的乙醇30m L，超聲40m in，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，隨著乙醇濃度的增加，黃酮得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)濃度達(dá)到60%時(shí)得率最高，濃度再增加時(shí)黃酮得率反而下降。這可能與黃酮物質(zhì)極性有關(guān)，極性不同，水溶性也不同，荷葉黃酮既有水溶性的又有非水溶性的，乙醇濃度過(guò)高時(shí)水溶性黃酮無(wú)法溶出，過(guò)低時(shí)非水溶性黃酮又浸出不完全。因此選用60%乙醇為宜。

圖3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.3 Effectof ethanol concentration on yield of total flavonoids

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮提取得率的影響 分別在一定量荷葉粉末中加入濃度為60%的乙醇20、25、30、35、40、45、50m L，超聲40m in，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，隨著溶劑量的增加，黃酮得率不斷增加，在料液比1∶35時(shí)達(dá)到最高，之后溶劑量再增加其得率基本不變，趨于恒定。這是由于在超聲波作用下黃酮迅速溶出，隨著溶劑量的增加得率升高，直至溶劑用量為1∶35時(shí)黃酮全部溶出得率最高。因此選取料液比1∶35為宜。

圖4 料液比對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.4 Effectof solid/liquid ratio on yield of total flavonoids

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的影響 在一定量荷葉粉末中加入濃度為60%的乙醇35m L，分別超聲20、40、60、80、100、120min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，超聲時(shí)間80m in左右，荷葉黃酮得率達(dá)到最高，超過(guò)80m in后得率呈下降趨勢(shì)。原因可能是超聲80m in時(shí)黃酮已充分溶出，此后繼續(xù)超聲會(huì)增加機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)對(duì)黃酮分子空間結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致得率下降。因此超聲時(shí)間選取80min為宜。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.5 Effectof ultrasound time on yield of total flavonoids

2.2.4 滲漉速度對(duì)總黃酮提取得率的影響 在一定量荷葉粉末中加入濃度為60%的乙醇35m L，超聲80min，在滲漉液收集體積為9倍的條件下考察滲漉速度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，隨著滲漉速度的增加，黃酮得率逐漸升高，當(dāng)速度達(dá)到3m L/min時(shí)得率最高，隨后速度再增加得率反而下降。原因可能是溶劑流速為3m L/min時(shí)與黃酮溶出速率一致，黃酮滲漉充分，得率達(dá)到最大，溶劑流速再增加使得滲漉液稀釋?zhuān)S酮得率隨之下降。因此選取滲漉速度3m L/min為宜。

圖6 滲漉速度對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.6 Effectof diacolation rate on yield of total flavonoids

2.2.5 滲漉液收集體積對(duì)總黃酮提取得率的影響 在一定量荷葉粉末中加入濃度為60%的乙醇35m L，超聲80m in，在滲漉速度為3m L/m in時(shí)考察滲漉液收集體積的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，隨著滲漉液收集體積的增加，黃酮得率不斷提高，在9倍體積時(shí)得率達(dá)到最高，隨后滲漉液體積再增加得率反之下降?？赡芘c荷葉中黃酮含量有關(guān)，在收集9倍滲漉體積時(shí)黃酮成分已充分溶出，得率最大，溶劑量再增加使得單位體積黃酮含量下降即得率下降。因此選取9倍滲漉液收集體積為宜。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 由Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均為單

次實(shí)驗(yàn)，以3次實(shí)驗(yàn)的平均值為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

圖7 滲漉液收集體積對(duì)總黃酮提取得率的影響Fig.7 Effect of percolate volume on yield of total flavonoids

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken response surface designmatrix and experimental results

以乙醇濃度、料液比、滲漉液收集體積為因素值，總黃酮得率為響應(yīng)值建立的模型回歸方程為：Y= 6.8379-0.2685X1+0.2544X2+0.124X3-0.223X1X2-0.083X1X3-0.0019X2X3-0.3897X12-0.4061X22-0.3317X32；對(duì)模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，如表3所示，模型p小于0.05表明模型顯著，不同處理間的差異顯著；相關(guān)系數(shù)R2為0.8904，說(shuō)明模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差??；失擬項(xiàng)p大于0.05，失擬不顯著，此模型可以預(yù)測(cè)荷葉總黃酮得率的變化。由表3中p可知，模型的X1、X2、X12、X22、X32各項(xiàng)對(duì)黃酮得率的影響顯著，其中乙醇濃度對(duì)黃酮影響最大，其次是料液比，最后是滲濾液收集體積，而交互項(xiàng)對(duì)黃酮得率的影響表現(xiàn)為不顯著，各因素對(duì)響應(yīng)值交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖8。

由圖8可以看出，乙醇濃度對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)曲線坡度大于料液比、滲漉液收集體積的曲線，說(shuō)明乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響大于二者；在一定范圍內(nèi)，黃酮得率隨著料液比和滲漉液收集體積的水平值的增大呈先升高后降低的趨勢(shì)，但滲漉液收集體積的曲線變化趨勢(shì)較為平緩，說(shuō)明料液比對(duì)黃酮得率的影響較滲漉液收集體積明顯，此模型預(yù)測(cè)結(jié)果與方差分析結(jié)果相符合，也再次驗(yàn)證了預(yù)測(cè)結(jié)果的可實(shí)性。對(duì)回歸方程求導(dǎo)得：X1=-0.5，X2=0.45，X3= 0.25，即得乙醇濃度為57.5%，料液比為1∶41.75g/m L，滲漉液收集體積為9.75倍，此時(shí)總黃酮預(yù)測(cè)得率最大，為6.98%。

2.3.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬結(jié)果分析 取乙醇濃度、料液比、滲漉液收集體積作為樣本，將17組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為樣本輸入，以荷葉黃酮得率作為待建立模型輸出層的響應(yīng)信號(hào)，通過(guò)改變不同隱含層的單元數(shù)不斷計(jì)算輸出響應(yīng)值與期望輸出值的誤差從而對(duì)模型進(jìn)行比較，已知誤差范圍在0.9～1之間模型均具有較高準(zhǔn)確度，但誤差越小模型模擬度越合適，因此選擇隱含

層為1，隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)為3模型結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖9，此時(shí)預(yù)測(cè)值和響應(yīng)值的誤差最小，為0.485，然后用此模型對(duì)17組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬訓(xùn)練，其預(yù)測(cè)得率與實(shí)驗(yàn)值對(duì)比如圖10所示。模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值非常接近，說(shuō)明模型具有較好的擬合效果，可以用此神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)荷葉黃酮的提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表3 回歸方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation

圖8 乙醇濃度、料液比和滲漉液收集體積對(duì)荷葉黃酮得率的影響Fig.8 Effectof ethanol concentration,solid/liquid ratio and percolate volume on yield of total flavonoids

誤差計(jì)算公式：

圖9 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig.9 The BP neural network diagram

圖10 實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值擬合圖Fig.10 The correlation ofactual values and the predicted values

其中，n為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)次數(shù)；Pi為預(yù)測(cè)值，Ti為響應(yīng)值。

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的優(yōu)化預(yù)測(cè)，得到荷葉黃酮的最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度60.2%，料液比為1∶39.7g/m L，滲漉液收集體積為9.2倍，此條件下黃酮得率預(yù)測(cè)值為6.74%。對(duì)優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證，并與Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化的預(yù)測(cè)值、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的實(shí)際值進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)誤差較響應(yīng)面優(yōu)化的相對(duì)誤差小，且神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化的工藝條件所提取的黃酮得率更高，說(shuō)明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可以更好地預(yù)測(cè)不同工藝參數(shù)下荷葉中總黃酮的得率。

表4 優(yōu)化條件下的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值的比較Table 4 Comparison of simulation and experimental results

2.4 荷葉黃酮穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 溫度對(duì)荷葉黃酮穩(wěn)定性的影響 結(jié)果如圖11所示，荷葉黃酮在20～40℃吸光度浮動(dòng)較小，黃酮對(duì)低溫較穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過(guò)40℃且水浴時(shí)間越長(zhǎng)，吸光度變化越大，原因是顯色劑與黃酮類(lèi)鄰位無(wú)取代基的鄰二酚羥基反應(yīng)，而加熱可能導(dǎo)致黃酮越多地轉(zhuǎn)變或分解為鄰位無(wú)取代基的鄰二酚羥基。從而使得荷葉黃酮在大于40℃對(duì)熱不穩(wěn)定，因此應(yīng)在40℃以下保存使用。

圖11 溫度對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effectof temperature on the stability of total flavonoids

2.4.2 酸堿對(duì)荷葉黃酮穩(wěn)定性的影響 結(jié)果如圖12

所示，浸提液的吸光度在pH4.0～5.0微酸性條件下最大，與原浸提液吸光度最接近，說(shuō)明黃酮穩(wěn)定存在，pH＞6.0偏堿性條件下浸提液吸光度隨之下降，黃酮不能穩(wěn)定存在，說(shuō)明荷葉黃酮在酸堿度較高的環(huán)境中不穩(wěn)定，微酸性環(huán)境更宜于荷葉黃酮的貯存。

圖12 pH對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effectof pH on the stability of total flavonoids

2.4.3 光照對(duì)荷葉黃酮穩(wěn)定性的影響 結(jié)果如圖13所示，放置8d后不同光照條件對(duì)黃酮穩(wěn)定性的影響順序?yàn)樘?yáng)光＞自然光＞避光，其中在太陽(yáng)光條件下溶液吸光度下降17.94%，在自然光條件下下降10.63%，在避光條件下下降7.84%?？赡芤?yàn)楣庹諚l件使得黃酮自身氧化聚合，發(fā)生降解，顏色也由亮綠色轉(zhuǎn)變?yōu)楹贮S色；而避光保存下的溶液顏色仍為亮綠色且吸光度變化不明顯，因此荷葉黃酮浸提液應(yīng)避光保存。

圖13 光對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.13 Effectof lighton the stability of total flavonoids

2.4.4 β-環(huán)糊精對(duì)荷葉黃酮穩(wěn)定性的影響 結(jié)果如圖14所示，在添加量為0.25%～2.0%間溶液吸光度均比不加β-環(huán)糊精的溶液要高，這可能與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，β-環(huán)糊精具有中空?qǐng)A筒立體環(huán)狀內(nèi)腔，可將黃酮包含在其空腔內(nèi)而起到保護(hù)作用，增加了黃酮的穩(wěn)定性。此外，β-環(huán)糊精還具有去除荷葉浸提液澀味的作用。

圖14 β-環(huán)糊精對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.14 Effect ofβ-cd on the stability of total flavonoids

2.4.5 VC對(duì)荷葉黃酮穩(wěn)定性的影響 結(jié)果如圖15所示，0～0.05%VC添加量對(duì)荷葉黃酮有保護(hù)作用，表現(xiàn)為浸提液吸光度增加，而用量超過(guò)0.1%后吸光度值直線下降，可能因?yàn)閂C具有羥基，可作為氫供體而被氧化，從而保護(hù)黃酮鄰羥基氧化成醌，但用量過(guò)度氧化型VC又作為氫受體奪取黃酮鄰羥基的氫離子，導(dǎo)致黃酮氧化降解，因此VC對(duì)荷葉黃酮有雙重作用，應(yīng)注意其添加量。

圖15 VC對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.15 Effect of VCon the stability of total flavonoids

2.4.6 D-葡萄糖酸內(nèi)酯對(duì)荷葉黃酮穩(wěn)定性的影響

結(jié)果如圖16所示，溶液吸光度隨著D-葡萄糖酸內(nèi)酯用量的增加呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，表明D-葡萄糖酸內(nèi)酯對(duì)荷葉黃酮有保護(hù)作用。D-葡萄糖酸內(nèi)酯擁有四個(gè)羥基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，溶于水釋放氫離子，抑制了黃酮的羥基氧化從而起到保護(hù)作用，但用量過(guò)大導(dǎo)致溶液過(guò)酸而不適宜黃酮的保存，因此用D-葡萄糖酸內(nèi)酯來(lái)保護(hù)荷葉黃酮時(shí)也應(yīng)注意其用量。

圖16 D-葡萄糖酸內(nèi)酯對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響Fig.16 Effectof D-glucose acid lactone on the stability of total flavonoids

3 結(jié)論

荷葉黃酮優(yōu)化后的提取工藝為乙醇濃度60.2%，料液比為1∶39.7g/m L，滲漉液收集體積為9.2倍，預(yù)測(cè)總黃酮的得率為6.74%，實(shí)際得率為6.87%，表明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型與響應(yīng)面的結(jié)合能很好地預(yù)測(cè)工藝條

件；荷葉黃酮在低溫、pH 5.0左右、黑暗條件下貯藏或加工對(duì)黃酮較為有利，此外添加β-環(huán)糊精和D-葡萄糖酸內(nèi)酯對(duì)荷葉黃酮有一定的保護(hù)作用，此研究為荷葉黃酮的提取加工提供了參考。

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Optimization of extraction technology of total flavonoids from lotus leafby BP neural network and exploration of flavonoids stability

HUO Dan-qun1，F(xiàn)ENG Dan1，ZHOU Rong-ling1，SONG Xing-xing1，ZHOU Jun1，2，SHEN Xiao-juan1，2，SHEN Cai-hong2，HOU Chang-jun1，*
（1.College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China；2.National Engineering Research Center of Solid-State Brewing，Luzhou Laojiao Group Co.，Ltd.，Luzhou 646000，China）

Box-Behnken response surface design coupled with neural network model was employed as a newmethod to optimize the conditions for ultrasonic-diacolation-assisted extraction of total flavonoids from lotusleaf. And the paper also studied the stability of flavonoids. The optimal extraction conditions were ethanolconcentration of 60.2%，material-to-liquid ratio of 1∶39.7，extraction duration of 80min，and collecting 9.2 foldsof percolate at a rate of 3mL/min. The extraction yield of total flavonoids was 6.87% ，the deviation betweenobserved and predicted values of yield was 1.89% ，which indicated the reliability and practicability in theoptimized conditions. It also suggested that the extracted total flavonoids were more stable at low temperature，low pH value and in dark condition，β-cyclodextrin，vitamin C or D-glucose acid lactone also improved thestability of the total flavonoids.

lotus leaf；flavonoids；response surface design；stability

TS262.8

：B

：1002-0306（2014）16-0274-07

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.052

2013－12－18 *通訊聯(lián)系人

霍丹群（1965-），女，博士，教授，主要從事微生物資源開(kāi)發(fā)與利用、生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能等方面的研究。

國(guó)家自然科研究學(xué)基金（81102132，31171684）；四川省科技支撐計(jì)劃（2010NZ0093）；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（NJ2011-03）；重慶大學(xué)大型儀器設(shè)備開(kāi)放基金。