李若綺，韓 玲，*，李儒仁，韓廣星，左秀峰，余群力，安邁瑞

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.山東綠潤食品有限公司，山東臨沂276000）

超聲波輔助提取牛睪丸中精蛋白工藝優(yōu)化

李若綺1，韓 玲1，*，李儒仁1，韓廣星2，左秀峰2，余群力1，安邁瑞1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.山東綠潤食品有限公司，山東臨沂276000）

以牛睪丸為原料，確定超聲波輔助法提取牛睪丸精蛋白的最優(yōu)工藝條件。實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)模型確定最佳提取條件為：硫酸濃度5.5%、超聲波功率190W、提取時(shí)間10min，牛睪丸精蛋白產(chǎn)率為4.19%，精蛋白含量為66.70μg/g，產(chǎn)率比硫酸提取法提高了33.87%，提取時(shí)間縮短至10min，蛋白質(zhì)含量增加了6.47μg/g，選擇95%的乙醇作為沉淀劑時(shí)，乙醇體積比1∶3時(shí)，所得精蛋白粗品的產(chǎn)率、水溶性和色澤均最佳。

響應(yīng)面法，超聲波輔助提取，牛睪丸精蛋白

精蛋白（Protam ine）是一種多聚陽離子堿性天然抗菌肽類，一般由30～50個(gè)氨基酸組成，主要以精氨酸為主。常與DNA結(jié)合，其中DNA含量約占總量2/3，精蛋白占總量1/3[1-4]。精蛋白在臨床上具有提高肝功能、助呼吸、促消化、降血壓、抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用及治療糖尿病等功能[5]。許多種動(dòng)物成熟精巢組織中均可提取到精蛋白，并就其作用及基因序列進(jìn)行了大量研究[6]。近年來，人們?nèi)找骊P(guān)注它的另一項(xiàng)作用，即精蛋白可作為增味劑、調(diào)味劑、防腐劑，廣泛應(yīng)用于諸如米飯、中華面、炒面、饅頭、餃子等淀粉類食品中，還可與醋酸鈉、甘氨酸、乙醇等復(fù)配后用于蛋糕、糊狀食品[7-9]。

精蛋白提取通常利用大多數(shù)蛋白質(zhì)不溶于NaCl（0.14mol/L）但溶于硫酸的原理，將大部分蛋白質(zhì)沉淀溶解，進(jìn)而利用有機(jī)溶劑降低溶液介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子間不同電荷吸引力，使精蛋白在有機(jī)溶劑中沉淀析出[10]。超聲波輔助提取法較上述提取方法，在提取過程中加入了超聲波處理工序，降低了蛋白質(zhì)變性失活幾率，且超聲波作用均勻，因而得到目的產(chǎn)物較快、較純。

目前，人們已提取的動(dòng)物精蛋白，主要來源于魚類，而對(duì)哺乳動(dòng)物精蛋白提取工藝的相關(guān)報(bào)道較少。作為畜產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)大國，我國肉牛生產(chǎn)總量位居世界前列。隨著肉牛養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，副產(chǎn)物也隨之大量增加，而大部分的副產(chǎn)物都被浪費(fèi)。因此，利用臟器資源，提取牛睪丸精蛋白具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)牛睪丸精蛋白得率進(jìn)行分析，研究牛睪丸精蛋白的最佳提取方法及提取工藝參數(shù)，為精蛋白提取及其產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛睪丸 山東綠潤食品有限公司，用水洗清潔后除去附著在睪丸上的脂肪、結(jié)締組織、血塊和污物等，將處理過的樣品于-80℃下凍藏待用；氯化鈉、濃硫酸、三氯乙酸、乙醇、丙酮、乙醚、異丙醇 上述所用試劑均為分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

JY92-ⅡDN型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；756P型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；FA1204B型電子天平 上海佑科儀表有限公司；JJ-2B型組織搗碎勻漿機(jī) 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要工藝流程

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 準(zhǔn)確稱取100g解凍的牛睪丸，置于組織搗碎機(jī)中，加入200m L的NaCl（0.14mol/L）溶液勻漿1min，冰浴攪拌20min后靜置10min。所得勻漿液離心（4000r/m in，0℃，10m in），棄去上清液，所得沉淀即脫氧核糖核蛋白（DNP）[11]。在提取的脫氧核糖核蛋白中加入一定量不同濃度的硫酸溶液，進(jìn)行超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白[12]，提取后離心（4000r/min，0℃，10m in），分離上清液，所得沉淀加入上述硫酸溶液重溶后重復(fù)上述操作一次，將兩次操作的上清液合并，加入有機(jī)溶劑冰浴沉淀30m in后離心10m in（8000r/min，0℃），所得沉淀用丙酮洗滌2次，乙醚洗滌1次后真空干燥，得牛睪丸精蛋白。

1.2.4 精蛋白含量檢測(cè) 采用考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)含量測(cè)定法[13]。

1.2.5 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白硫酸濃度的確定 分別配制不同濃度的硫酸溶液（2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%），按照1.2.2操作要求在提取的脫氧核糖核蛋白中加入硫酸溶液，用200W超聲提取精蛋白30m in，加入有機(jī)溶劑沉淀離心制取牛睪丸精蛋白。

1.2.5.2 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白超聲波功率的確定 配制濃度為7.5%的硫酸溶液，設(shè)置超聲波功率為：100、200、300、400、500、600W，提取時(shí)間30m in，采用1.2.2方法制取牛睪丸精蛋白。

1.2.5.3 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白提取時(shí)間的確定 配制濃度為7.5%的硫酸溶液，設(shè)置超聲波功率為400W，提取牛睪丸精蛋白方法同1.2.2，其中提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60m in。

1.2.6 超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白的優(yōu)化在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取硫酸濃度、提取時(shí)間和超聲波功率為實(shí)驗(yàn)因素，以精蛋白得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)模型對(duì)超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，共設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)17組，每組做三個(gè)平行，利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以獲得最佳參數(shù)。每一個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼。實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼Table 1 Chartof coding factors

1.2.7 沉淀劑的篩選在1.2.2實(shí)驗(yàn)中，分別以不同體積比（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4）的乙醇（95%）、丙酮、三氯乙酸（60%）、異丙醇作為沉淀劑沉淀牛睪丸精蛋白。以精蛋白產(chǎn)率、所得產(chǎn)品溶解性、色澤為指標(biāo)，選擇出最佳沉淀劑和沉淀劑最佳用量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用M icrosoft Excel和Design Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 硫酸濃度對(duì)精蛋白產(chǎn)率影響 由圖1可知，在超聲波功率300W、提取時(shí)間為20min的條件下，隨著硫酸濃度從2.5%增加到12.5%，精蛋白產(chǎn)率先快速上升后緩慢下降，且在5%時(shí)產(chǎn)率最高為3.54%；硫酸濃度過低時(shí)，結(jié)合精蛋白少，生成精蛋白硫酸鹽少，提取不完全，而硫酸濃度過高時(shí)，蛋白質(zhì)可能被部分水解；硫酸濃度在12.5%后，精蛋白產(chǎn)率會(huì)更低。由此，初步確定硫酸濃度范圍為2.5%～10%。

圖1 硫酸濃度對(duì)牛睪丸精蛋白產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of sulfuric acid concentration on testicular productivity

2.1.2 超聲波功率對(duì)產(chǎn)率影響 由圖2可知，在硫酸濃度為5%、提取時(shí)間為20min的條件下，隨著超聲波功率從100W增加到300W，精蛋白產(chǎn)率先上升后下

降，且當(dāng)功率達(dá)到200W時(shí)精蛋白產(chǎn)率最高為3.67%，這是因?yàn)槌暡ǖ目栈?yīng)和機(jī)械效應(yīng)會(huì)促進(jìn)溶劑向精蛋白表面擴(kuò)散，促進(jìn)精蛋白硫酸鹽的生成，但隨著功率的增大可能會(huì)引起部分蛋白質(zhì)的降解，而且對(duì)于特定的物質(zhì)，超聲作用的效果取決于超聲頻率和提取物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，不同的提取物有不同適宜的提取超聲功率；功率在400W處精蛋白產(chǎn)率略有上升，但不明顯。據(jù)此初步確定超聲波功率范圍為100～400W。

圖2 超聲波功率對(duì)牛睪丸精蛋白產(chǎn)率的影響Fig.2 Effectof ultrasound power on testicular productivity

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)產(chǎn)率影響 由圖3可知，在硫酸濃度為5%、超聲波功率300W的條件下，隨著提取時(shí)間從10m in增加到60m in，精蛋白產(chǎn)率先上升后持續(xù)下降，且在提取時(shí)間20m in達(dá)到最大值為3.58%，下降趨勢(shì)在提取時(shí)間為40m in后趨于平緩，這是因?yàn)榻^大多數(shù)的精蛋白都在20m in內(nèi)被提取出來，隨著時(shí)間進(jìn)一步的延長(zhǎng)部分蛋白質(zhì)會(huì)溶解。綜合考慮經(jīng)濟(jì)和效率等因素，初步確定提取時(shí)間范圍為10～40m in。

圖3 提取時(shí)間對(duì)牛睪丸精蛋白產(chǎn)率的影響Fig.3 Effectof extraction time on testicular productivity

2.2 超聲波提取工藝參數(shù)優(yōu)化

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)模型能用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)進(jìn)行全面的分析研究[14-17]。以硫酸濃度、提取時(shí)間和超聲波功率為實(shí)驗(yàn)因素，以精蛋白產(chǎn)率為響應(yīng)值，各實(shí)驗(yàn)因素水平編碼如表1所示，共實(shí)施17組響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。用Design-Expert 8.05進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，各組實(shí)驗(yàn)列表及產(chǎn)率見表2。

2.2.1 回歸模型建立及檢驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，精蛋白產(chǎn)率在3.7%～4.3%之間。借助Design-Expert 8.05軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，獲得對(duì)牛睪丸精蛋白產(chǎn)率Y的二次回歸模型為：

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 Results of response surface analysis

上述二次回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

由表3方差分析可知，回歸模型的p＜0.01，表明回歸模型極其顯著；失擬項(xiàng)p＞0.05，失擬不顯著，說明模型所擬合的二次回歸方程與實(shí)際相符合，能正確反映牛睪丸精蛋白產(chǎn)率Y與X1、X2和X3之間的關(guān)系，回歸模型可以較好地對(duì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.3 各因素對(duì)性能指標(biāo)的影響分析

2.3.1 硫酸濃度和超聲波功率對(duì)精蛋白產(chǎn)率的影響

令X3=0，得硫酸濃度X1和超聲波功率X2與精蛋白產(chǎn)率Y之間的偏回歸方程為：

Y=3.565+0.22X1+8.61111×10-4X2+1.33333× 10-4X1X2-0.022756X12-4.22222×10-6X22

圖4 硫酸濃度和超聲波功率對(duì)應(yīng)精蛋白產(chǎn)率的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graph of testicular productivity between sulfuric acid concentration and ultrasonic power

由圖4可以看出，硫酸濃度由2.5%向7.0%變化時(shí)，

精蛋白產(chǎn)率不斷增大，且上升趨勢(shì)較明顯。當(dāng)硫酸濃度固定在某一水平時(shí)，隨超聲波功率的增加（100～400W），精蛋白產(chǎn)率變化不大。由此說明在硫酸濃度變化不大時(shí)，精蛋白產(chǎn)率對(duì)于在一定范圍內(nèi)超聲波功率的變化不很敏感。由偏回歸分析和方差分析可知，硫酸濃度對(duì)精蛋白產(chǎn)率的影響大于超聲波功率。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Results of ANOVA

2.3.2 硫酸濃度和提取時(shí)間對(duì)精蛋白產(chǎn)率的影響 令X2=0，得硫酸濃度X1和提取時(shí)間X3與精蛋白產(chǎn)率Y之間的偏回歸方程為：

圖5 硫酸濃度和提取時(shí)間對(duì)應(yīng)精蛋白產(chǎn)率之間的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph of testicular productivity between sulfuric acid concentration and extraction time

由圖5可以看出，提取時(shí)間由10m in向40m in變化時(shí)，精蛋白產(chǎn)率變化不大。當(dāng)提取時(shí)間固定在某一水平時(shí)，隨硫酸濃度的增加，精蛋白產(chǎn)率明顯先快速上升（2.5%～6.0%），然后下降（6.0%～10%）。由此說明在提取時(shí)間變化不大時(shí)，精蛋白產(chǎn)率對(duì)于在一定范圍內(nèi)硫酸濃度變化非常敏感。由方差分析和偏回歸分析可以得出，硫酸濃度對(duì)精蛋白產(chǎn)率的影響大于提取時(shí)間。

2.3.3 超聲波功率和提取時(shí)間對(duì)精蛋白產(chǎn)率的影響

令X1=0，得超聲波功率X2和提取時(shí)間X3與精蛋白產(chǎn)率Y之間的偏回歸方程為：

圖6 提取時(shí)間和超聲波功率對(duì)應(yīng)精蛋白得率之間的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph of testicular productivity between ultrasonic power and extraction time

由圖6可以看出，超聲波功率由80W向200W變化時(shí)，精蛋白產(chǎn)率不斷增大，且上升趨勢(shì)較明顯，從200W開始到600W時(shí)，產(chǎn)率隨著超聲波功率增加而快速降低。當(dāng)超聲波功率固定在某一水平時(shí)，隨提取時(shí)間的增加，精蛋白產(chǎn)率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。由此說明，精蛋白產(chǎn)率對(duì)一定范圍內(nèi)超聲波功率變化和提取時(shí)間變化都較為很敏感。由方差分析和偏回歸分析可以得出，超聲波功率對(duì)精蛋白產(chǎn)率的影響大于提取時(shí)間。

2.4 最優(yōu)作業(yè)參數(shù)確定及模型驗(yàn)證

通過對(duì)回歸方程模型進(jìn)行優(yōu)化求解，以精蛋白產(chǎn)率最大值（4.21%）作為相應(yīng)結(jié)果，從Design Expert軟件中可得到超聲波輔助牛睪丸精蛋白提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：硫酸濃度5.48%、超聲波功率188.54W和提取時(shí)間10m in。3個(gè)因素對(duì)牛睪丸精蛋白產(chǎn)率影響主次順序?yàn)椋毫蛩釢舛取⒊暡üβ屎吞崛r(shí)間。

為了進(jìn)一步為了驗(yàn)證模型的可靠性，采用響應(yīng)

面所得最優(yōu)條件的調(diào)整參數(shù)（硫酸濃度5.5%、超聲波功率190W，提取時(shí)間10min）進(jìn)行精蛋白提取實(shí)驗(yàn)。從表4可以看出，兩種方法提取牛睪丸精蛋白后產(chǎn)率分別為3.13%、4.19%，蛋白含量分別為60.23、66.70μg/g。該產(chǎn)率與Design Expert模擬結(jié)果相比，相對(duì)誤差為0.24%。同硫酸提取實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)結(jié)果相比，產(chǎn)率相對(duì)提高了33.87%，提取時(shí)間縮短至10m in。因此，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的牛睪丸精蛋白提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作。

表4 牛睪丸中精蛋白含量及產(chǎn)率Table 4 Testicular productivity and content in bovine testis

2.5 沉淀劑的篩選

2.5.1 沉淀劑種類選擇 分別用乙醇（95%）、三氯乙酸（60%）、異丙醇、丙酮沉淀牛睪丸精蛋白，所得精蛋白粗品的產(chǎn)率、水溶性和色澤見表5。

表5 不同沉淀劑效果比較Table 5 Results of precipitation using different reagent

從表5可以看出，以產(chǎn)率而言，95%乙醇、60%三氯乙酸的產(chǎn)率較高，其中以60%三氯乙酸為沉淀劑的產(chǎn)率最高。從溶解性來看，以丙酮、60%三氯乙酸、為沉淀劑所得產(chǎn)品的溶解性不好，難溶解，有沉淀。綜合考慮，選擇95%乙醇作為沉淀劑。

2.5.2 沉淀劑95%乙醇用量確定 由圖7可知，95%乙醇體積比為1∶1、1∶1.5、1∶2時(shí)，精蛋白產(chǎn)率在3%以下，當(dāng)沉淀劑體積比增加到1∶2.5時(shí)，產(chǎn)率為3.28%；當(dāng)沉淀劑的體積比為1∶3時(shí)，精蛋白產(chǎn)率最高為4.2%；隨著沉淀劑體積比的增加，牛睪丸精蛋白粗品的產(chǎn)率緩慢下降。所以選擇體積比為1∶3的95%乙醇作為沉淀劑來沉淀牛睪丸精蛋白。

圖7 不同體積比對(duì)應(yīng)牛睪丸精蛋白產(chǎn)率Fig.7 Testicular productivity using different volume ratio in bovine testes

3 結(jié)論

經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析，本實(shí)驗(yàn)所得出結(jié)論如下：

3.1 結(jié)合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析方法，進(jìn)行超聲波輔助提取牛睪丸精蛋白工作參數(shù)優(yōu)化，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果可得影響精蛋白產(chǎn)率的因素由大到小依次為：硫酸濃度、超聲波功率和提取時(shí)間。

3.2 由回歸模型得出超聲波輔助法提取牛睪丸精蛋白最佳工藝參數(shù)為：硫酸濃度5.48%、超聲波功率188.54W和提取時(shí)間10m in，實(shí)際操作選擇硫酸濃度為5.5%、超聲波功率為190W，提取時(shí)間10m in。

3.3 超聲波輔助法提取牛睪丸精蛋白優(yōu)于硫酸提取法，超聲波輔助法比硫酸提取法產(chǎn)率提高了33.87%，提取時(shí)間縮短至10m in，蛋白質(zhì)含量增加了6.47μg/g。

3.4 以95%乙醇作為沉淀劑來沉淀牛睪丸精蛋白，當(dāng)乙醇體積比為1∶3時(shí)，精蛋白產(chǎn)率最高。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)確定了超聲波輔助法提取牛睪丸精蛋白優(yōu)化工藝參數(shù)，為精蛋白工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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Optimization of ultrasonic assistant protamine extraction processingparameters using response surface methodology in bovine testes

LIRuo-qi1，HAN Ling1，*，LIRu-ren1，HAN Guang-xing2，ZOU Xiu-feng2，YU Qun-li1，AN Mai-rui1
（1.College of Food Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Shandong Lorain Food Company，Linyi276000，China）

Experiments of extracting protamine with ultrasound assistant processing in bovine testes weredesigned using Box-Behnken response surface methodology. The optimal extraction processing parametersbased on design expert were：5.5% sulfuric acid，190W of ultrasonic and extraction time was 10min. Comparedwith the traditional extraction method，this study raised the protamine productivity up to 33.87%，decreased theextraction time to 10min and increased the content of protamine with up to 6.47μg/g as well. In addition，whilethe optimal precipitating reagent was 95% ethanol，volumeration 1∶3 for testicular precipitation，protamine productyield，water soluble and color were the best.

response surface methodology；ultrasonic assistant；testicular protamine

S872

：B

：1002-0306（2014）16-0212-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.039

2013-11-06 *通訊聯(lián)系人

李若綺（1987-），女，碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目資助（CARS-38）；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助（201203009）。