羅光宏，張喜峰，張麗娟，李靜雅，李小霞

（1.河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅張掖734000；2.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000）

響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相萃取棉花葉中總黃酮的研究

羅光宏1，張喜峰2，*，張麗娟2，李靜雅2，李小霞2

（1.河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅張掖734000；2.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000）

采用乙醇-硫酸銨雙水相體系分離純化棉花葉中總黃酮，確定其雙水相體系組成為23%無水乙醇-22%（NH4）2SO4，通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)研究粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)三個(gè)變量對棉花葉中總黃酮響應(yīng)值的影響程度，用響應(yīng)面法得出三個(gè)考察因素最優(yōu)工藝參數(shù)，即：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)31%、pH4、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，在此條件下萃取率為76.32%。與響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮萃取率預(yù)測值78.02%接近，為棉花葉中總黃酮有效開發(fā)利用提供一定的借鑒作用。

響應(yīng)面法，棉花葉片，黃酮

棉花葉中存在黃酮類化合物，它是重要的抗病蟲害物質(zhì)[1]。目前對棉花葉中黃酮類化合物的提取研究報(bào)道較少。馬彥梅等[2]對棉花根莖葉黃酮化合物進(jìn)行了超聲提取，主要側(cè)重于如何提高目標(biāo)產(chǎn)物萃取率，忽略了目標(biāo)成分與雜質(zhì)的分離問題。而雙水相萃取是利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異進(jìn)行萃取的方法[3]。短鏈醇/鹽體系作為一種新型的雙水相體系，因原料豐富、價(jià)格低廉、溶劑粘度小、傳質(zhì)速度快、能除去大量雜質(zhì)、試劑易回收等優(yōu)點(diǎn)，引起了廣泛關(guān)注，已被用于生物化工、天然產(chǎn)物等領(lǐng)域[4]。采用短鏈醇/鹽雙水相體系提取棉花葉黃酮的方法尚未見報(bào)道。

利用乙醇/硫酸銨雙水相萃取技術(shù)對棉花葉中黃酮活性成分進(jìn)行提取，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法來優(yōu)化棉花葉中黃酮最佳提取條件，為棉花葉中黃酮有效利用和開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棉花葉片 采自甘肅民勤，經(jīng)洗凈、自然晾干、粉碎并過40目篩得到棉花葉粉末；蘆丁對照品 上海一基生物科技有限公司，純度＞98%；硝酸鋁 天津亞太龍興化工有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉 天津開發(fā)區(qū)花光化學(xué)制藥廠；硫酸銨 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、無水乙醇 天津市百世化工有限公司。

PL-203型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限

公司；XO-SM 5O型超聲波-微波反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司；DKB-501型數(shù)顯超級恒溫水浴鍋 揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司；DHG-9101.1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、722型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；FZ102型植物試樣粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 棉花葉總黃酮粗提液的制備 準(zhǔn)確稱取10g已粉碎的棉花葉粉末，以1∶10（g/m L）料液比加入到50%乙醇中，325W超聲10m in（超2s，停2s），抽濾，收集濾液得棉花葉總黃酮粗提液，測定粗提液中棉花葉總黃酮的含量。

1.2.2 黃酮測定 采用鋁離子絡(luò)合法[5]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，510nm處吸光值為縱坐標(biāo)，蘆丁的含量（mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=1.245x-0.0024（R2=0.992）。式中y為吸光值，x為蘆丁的含量（mg）。將棉花葉總黃酮提取液稀釋后按上述方法測定吸光值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算稀釋液中黃酮的質(zhì)量濃度。

1.2.3 雙水相萃取方法 稱取一定量無水乙醇、（NH4）2SO4、棉花葉總黃酮粗提液于小燒杯中，使雙水相體系總質(zhì)量為10.00g，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，并調(diào)節(jié)體系pH，靜置10m in，兩相達(dá)到相分離，棉花葉總黃酮富集于雙水相系統(tǒng)的上相中，測定相比R和棉花葉總黃酮的含量，并計(jì)算其分配系數(shù)K及萃取率Y，如下式：

R=Vt/VbK=Ct/Cb

Y（%）=（RK/1+RK）×100

式中：Vt為上相體積，m L；Vb為下相體積，m L；Ct為上相黃酮的質(zhì)量濃度，mg/m L；Cb為下相黃酮的質(zhì)量濃度，mg/m L。

1.2.4 乙醇-硫酸銨雙水相體系的確定 通過改變乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（19%、21%、23%、25%、27%）、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（18%、20%、22%、24%、26%）確定雙水相體系的組成。

1.2.5 影響棉花葉總黃酮萃取的因素

1.2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在確定了雙水相體系組成后，研究pH（3、4、5、6、7）、黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%、20%、30%、40%、50%）、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%、2%、3%、4%、5%）對黃酮提取率的影響。

1.2.5.2 Box-Behnken法優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇pH、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)這3個(gè)因素作為自變量，Box-Behnken響應(yīng)面法對萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and level in the Box-Benhnkenexperimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對棉花葉總黃酮萃取效果的影響 選取19%、21%、23%、25%、27%無水乙醇，22%（NH4）2SO4和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%粗提液組成雙水相體系，室溫條件下，混勻調(diào)節(jié)pH 7，靜置分層后，對上下相溶液進(jìn)行分析。

如圖1所示，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，棉花葉片黃酮的萃取率Y和分配系數(shù)K逐漸增大，在23%時(shí)達(dá)到最大值，這是因?yàn)榱蛩徜@的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，分相能力也就增強(qiáng)，上相中乙醇質(zhì)量也就隨之增加，而黃酮在乙醇中的溶解度比水中的大，所以萃取率Y和分配系數(shù)K均增大[6]。因此無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇為23%。此后，隨著無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率顯著下降，其主要原因可能是無水乙醇質(zhì)量增加了雙水相體系的分相能力增加，黃酮在乙醇中溶解度比在水中的大，但乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，其他有機(jī)物的溶出量也會(huì)增加，從而抑制了總黃酮的浸出[7]。

圖1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對棉花葉總黃酮分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.1 Effectof ethanol concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

2.1.2（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對棉花葉總黃酮萃取效果的影響 選取18%、20%、22%、24%、26%（NH4）2SO4，23%無水乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%粗提液組成雙水相體系，室溫條件下，混勻調(diào)節(jié)pH 7，靜置分層后，對上下相溶液進(jìn)行分析。

圖2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對棉花葉總黃酮分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.2 Effectof ammonium sulfate concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

由圖2可知，隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，分

配系數(shù)和萃取率先是逐漸上升，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到22%時(shí)呈下降趨勢。可見，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響雙水相體系，可以改變各相中成相物質(zhì)的組成和相比[8]，從而影響黃酮在上相中的分配，導(dǎo)致分配系數(shù)和萃取率隨（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降。因此（NH4）2SO4的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇22%。

2.1.3 pH對棉花葉總黃酮萃取效果的影響 在23% CH3CH2OH和22%（NH4）2SO4組成的雙水相體系中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%黃酮粗提液，調(diào)節(jié)體系pH分別為3、4、5、6、7，靜置分層后，對上下相溶液進(jìn)行分析。

如圖3所示，隨著雙水相體系pH逐漸升高，棉花葉總黃酮萃取率和分配系數(shù)逐漸增加，在pH4時(shí)，達(dá)到最大值。pH的變化改變了棉花葉黃酮的電性和表面性質(zhì)，同時(shí)也改變了無機(jī)離子的分配情況，從而影響兩相之間的電位差[9]，最終影響K值。pH為4時(shí)，棉花葉黃酮的萃取率最高。

圖3 體系pH對棉花葉總黃酮分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.3 Effect of pH on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

2.1.4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對棉花葉片黃酮分配行為的影響 在23%CH3CH2OH和22%（NH4）2SO4組成的雙水相體系中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%黃酮粗提液，添加1%、2%、3%、4%、5%NaCl，體系pH為4.0，靜置分層后，對上下相溶液進(jìn)行分析。無機(jī)鹽的加入能夠縮短分相時(shí)間從而影響萃取過程，而且無機(jī)鹽能夠影響雙水相兩項(xiàng)之間的電位差、相體積比和兩相中成相物質(zhì)的組成[10]。

圖4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對棉花葉總黃酮分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.4 Effectof NaCl concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

如圖4所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)NaCl添加量達(dá)到3%時(shí)，棉花葉黃酮萃取率最高；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過3%時(shí)，棉花葉黃酮萃取率下降。這可能是由于加入的NaCl過多導(dǎo)致鹽析現(xiàn)象的出現(xiàn)，棉花葉黃酮隨著鹽從兩相體系中一齊沉淀出來[11]。因此，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇為3%。

2.1.5 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對棉花葉片黃酮分配行為的影響 在雙水相體系萃取棉花葉片黃酮時(shí)，粗提液質(zhì)量數(shù)是影響萃取結(jié)果的重要因素。在以上獲得的最優(yōu)條件下，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%粗提液，靜置分層后，對上下相溶液進(jìn)行分析。如圖5所示，原液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，棉花葉片黃酮萃取率達(dá)到最高。當(dāng)原液質(zhì)量超過30%時(shí)，萃取率變化不大，且有下降的趨勢。因此確定最佳粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%。

圖5 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對棉花葉總黃酮分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.5 Effectof crude extrat concentration on partition coefficient（K）and yield（Y）of flavonoids in cotton leaves

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化與分析

用Design-Expert8.0軟件隨機(jī)產(chǎn)生Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)方案，在無水乙醇-（NH4）2SO4體系基礎(chǔ)上，對pH（A）、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）設(shè)計(jì)了3因素3水平的17組實(shí)驗(yàn)，對考察因素和其水平進(jìn)行設(shè)計(jì)，得出其17次實(shí)驗(yàn)響應(yīng)結(jié)果，見表2，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3。

將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合，根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到棉花葉片黃酮萃取率對編碼自變量pH、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的二次多元回歸方程式：

Y=77.86+0.4625A+1.5375B+0.675C+0.15AB-0.775AC+2.675BC-2.555A2-7.305B2-3.73C2

從方差分析結(jié)果可以看出，該回歸模型F檢驗(yàn)非常顯著（p＜0.001），調(diào)整后的決定系數(shù)R2值為0.9932，表明在考察值與模型預(yù)測值存在高度聯(lián)系。其中失擬項(xiàng)在p=0.05水平上不顯著（p=0.1952＞0.05），表明此模型擬合程度較好。各因素中B、BC、A2、B2、C2因素對黃酮結(jié)果有極顯著的影響（p＜0.01）；C、AC對黃酮結(jié)果的影響是顯著的。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，且對提取條件進(jìn)行優(yōu)化是可行的，得到的棉花葉片黃酮萃取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

通過Design-Expert 8.0軟件優(yōu)化功能再次優(yōu)化，

得出雙水相萃取棉花葉中黃酮萃取率最優(yōu)工藝參數(shù)，即：pH 4.07，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31.3%，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.13%，萃取率為78.02%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將雙水相萃取棉花葉黃酮在理論值基礎(chǔ)上修正為pH4，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31%，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

表3 棉花葉片提取工藝優(yōu)化模型方差分析Table 3 Mathematicalmodel a analysis of variance on ptimization extraction cotton blade flavonoids

根據(jù)回歸方程利用Design-Expert 8.0繪出響應(yīng)面圖，即圖6a～c。每個(gè)響應(yīng)面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第三個(gè)變量保持在最佳水平。圖6a顯示，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，pH與粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取黃酮的影響。由圖6a可知，pH對雙水相萃取黃酮的影響較小，曲面較平滑。粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取黃酮的影響較大，表現(xiàn)為較陡的曲面；圖6b顯示，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，pH與NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取黃酮的影響。由圖6b可知，當(dāng)pH一定時(shí)，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高，萃取率先增大后減小。圖6c顯示了粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取黃酮的影響。從圖6c可以看出，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)取某適中值時(shí)會(huì)使萃取率達(dá)到最大值，且過高或過低都會(huì)使萃取率降低。

圖6 各因素交互作用的等高線圖Fig.6 Contour plot for the pairwise interactive Effectof mass fraction of crude extract，pH andmass fraction of NaCl on extraction yield

2.3 驗(yàn)證響應(yīng)面法得出棉花葉中黃酮雙水相萃取的最佳條件

在修正條件下，即：pH 4，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31%，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，對模型預(yù)測值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，平行實(shí)驗(yàn)3次，棉花葉黃酮平均萃取率為76.32%，與響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黃酮萃取率預(yù)測值78.02%接近。因此，響應(yīng)面法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化是可行的，得到的棉花葉黃酮萃取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

雙水相體系中無水乙醇、（NH4）2SO4、pH、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取棉花葉黃酮均有影響，實(shí)驗(yàn)確定萃取棉花葉黃酮雙水相體系組成為23%無水乙醇-22%（NH4）2SO4，研究了pH、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系萃取棉花葉黃酮的影響，用響應(yīng)面曲線擬合出一個(gè)二次回歸方程，找出乙醇/硫酸銨雙水相體系萃取黃酮最優(yōu)組合為pH4、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31%、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，在該條件下進(jìn)行了3次平行實(shí)驗(yàn)，棉花葉黃酮平均萃取率為76.32%。研究結(jié)果為利用乙醇/硫酸銨雙水相體系從棉花葉中萃取分離黃酮提供了一種新的提取方法，對其他植物中黃酮的提取分離也有一定的參考和借鑒價(jià)值。

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Study on the optimization of aquoues two-phase extraction oftotal flavonoids from cotton leaves using response surface methodology

LUO Guang-hong1，ZHANG Xi-feng2，*，ZHANG Li-juan2，LI Jing-ya2，LIXiao-xia2
（1.Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province，Kaiyuan Bio-tech Development Center，HexiUniversity，Zhangye 734000，China；2.The College of Agriculture and Biotechnology（CAB），HexiUniversity，Zhangye 734000，China）

An aqueous two-phase system composed of 23% ethanol and 22% （NH4）2SO4 was used to extracttotal flavonoids from cotton leaves. Mass fraction of crude extract，pH and mass fraction of NaCl on the extractionefficiency of total flavonoids were explored by one-factor-at-a-time and Box-Benhnken design methods. Theresults showed that the optimal conditions were as follows ：crude extract concentration 31% ，pH4，NaClconcentration 3%. Under the above conditions the confirmed tests indicated that the extraction rate of totalflavonoids was 76.32% which had close relation with the predicted yield of the extraction rate of total flavonoidswas 78.02%. The study would provide reference for the effective utilization of flavonoids from cotton leaves.

response surface methodology；cotton leaves；flavonoids

TS210

：B

：1002-0306（2014）16-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.036

2013－08－05 *通訊聯(lián)系人

羅光宏（1965-），男，碩士研究生，教授，研究方向：天然產(chǎn)物分離。

甘肅省中小企業(yè)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（1110FCCG112）；甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心建設(shè)項(xiàng)目（1009FTGG017）。