樊曉琳，張德福，付緒磊，劉雪飛，孫嘉營(yíng)，白鳳翎，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”遼寧省高校重大科技平臺(tái)，遼寧錦州121013）

錦州筆架山海域海產(chǎn)品中副溶血弧菌的分子流行病學(xué)調(diào)查

樊曉琳，張德福，付緒磊，劉雪飛，孫嘉營(yíng)，白鳳翎，勵(lì)建榮*

（渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”遼寧省高校重大科技平臺(tái)，遼寧錦州121013）

為了解錦州筆架山周邊海域海產(chǎn)品中副溶血弧菌的污染狀況，實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)采集了藍(lán)圓鲹等共103份常見的海產(chǎn)品，按照GB/T 4789.7-2008及PCR方法對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示，隨機(jī)抽檢的103份樣品中，檢測(cè)出含副溶血弧菌的樣品38份，檢出率為37%。這表明，錦州筆架山周邊海域常見海產(chǎn)品受副溶血弧菌污染十分嚴(yán)重，具有極大的食品安全隱患。

海產(chǎn)品，副溶血弧菌，食源性疾病，分離鑒定，流行病學(xué)調(diào)查，PCR

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種革蘭氏陰性菌，呈短桿狀或弧狀，是一種常見的嗜鹽菌，廣泛地分布于近海岸海水、海底沉積物和魚、蝦、蟹等海洋生物中[1-2]。人們多因食用被該菌污染的海產(chǎn)品而引發(fā)食物中毒，患者可出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等典型的腸胃炎癥狀，重者甚至危及生命[3-5]。據(jù)我國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，在我國(guó)沿海城市，副溶血弧菌引起的食物中毒已經(jīng)高居微生物性食物中毒的首位[6]。

隨著經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)和人們生活水平的提高，海產(chǎn)品的消費(fèi)量日益增加，隨之而來的由副溶血弧菌所引起的食源性疾病時(shí)常出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)2013年6月～9月錦州筆架山海域的海產(chǎn)品進(jìn)行了隨機(jī)取樣調(diào)查，采用生理生化和分子生物學(xué)的方法對(duì)樣品中分離的副溶血弧菌進(jìn)行鑒定，以充分了解錦州筆架山海岸海產(chǎn)品受副溶血弧菌的污染狀況，為防治副溶血弧菌所引起的食源性疾病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802 購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，由本實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)樣品 2013年6～9月采自于錦州市筆架山沿岸多個(gè)地點(diǎn)的藍(lán)圓鲹10份、多春魚13份、鋸緣青蟹10份、四角蛤蜊20份、鮑魚15份、青柳蛤15份和縊蟶20份，共103份樣品；3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基

上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司；副溶血弧菌生化鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組柱式DNA小量制備試劑盒、DNA Marker、瓊脂糖、rTaqm ix 2×、引物 上海生工生物工程有限公司合成；革蘭氏染色液、1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液（用前配制）、1%α-萘酚-乙醇溶液、靛基質(zhì)試劑、液體石蠟、甘油等 由本實(shí)驗(yàn)室配制。

Mastercycler pro梯度PCR儀 德國(guó)艾本德股份有限公司；Thermo Micro 17R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Cheimd Doc XRS型凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；FA1004型精密電子天平 鄭州寶晶電子科技有限公司；Nikon EcLipse 80i型顯微鏡 日本尼康株式會(huì)社；DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái) 東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司；MLS-3030CH型立式高壓蒸汽滅菌器 三洋電機(jī)（廣州）有限公司；SPX 150型智能生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集與處理 在錦州筆架山海岸多個(gè)地點(diǎn)采集新鮮的藍(lán)圓鲹等海產(chǎn)品共103份。將其中的魚類樣品用75%乙醇對(duì)其體表消毒，然后無(wú)菌操作取出其內(nèi)臟、腮和魚肉；貝類樣品先用清水沖去表面的污泥，然后用鑷子撬開外殼，取出全部的貝肉和內(nèi)臟。將取出的樣品放在無(wú)菌培養(yǎng)皿上，用無(wú)菌剪刀剪碎后稱取25g加入到有225m L APW的錐形瓶中，37℃培養(yǎng)12h。

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 取培養(yǎng)12h后的混合物，挑取1環(huán)接種于TCBS瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12～14h。挑取TCBS上的綠色單菌落接種于科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12～14h。挑取科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上的紫紅色單菌落經(jīng)過3代純化后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)并于-80℃保存。

1.2.3 革蘭氏染色和生理生化實(shí)驗(yàn) 挑取上述科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上的紫紅色單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并于1000×光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)并記錄。

對(duì)革蘭氏染色后確定為革蘭氏陰性，呈弧狀或桿狀的細(xì)菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。先進(jìn)行初篩實(shí)驗(yàn)，包括氧化酶實(shí)驗(yàn)、動(dòng)力實(shí)驗(yàn)和嗜鹽性實(shí)驗(yàn)；后進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，包括H2S實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)。同時(shí)用副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802做對(duì)照，觀察各實(shí)驗(yàn)中的現(xiàn)象并記錄。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

1.2.4.1 PCR擴(kuò)增groEL特異性基因 挑取生化鑒定后的可疑菌株接種于APW的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，取培養(yǎng)后的菌液1m L按照細(xì)菌基因組柱式DNA小量制備試劑盒的操作說明，提取DNA。根據(jù)Hossain[7]的報(bào)道，選取副溶血弧菌的groEL特異性基因的引物及PCR反應(yīng)體系，對(duì)初步鑒定的疑似副溶血弧菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.2.4.2 16S rDNA檢測(cè)及同源性分析 以1.2.4.1中提取的DNA為模板，采用16S rDNA的通用引物[8]（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTG TTACGACTT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL， PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2m in，94℃變性1m in，60℃退火1min，72℃延伸95s，30個(gè)循環(huán)，延伸10min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后，送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

測(cè)序后的結(jié)果用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST程序分析，并應(yīng)用MEGA 5.0.5軟件，采用Neighbour-Joining方法構(gòu)建副溶血弧菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)分離細(xì)菌的同源性進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 副溶血弧菌的分離

副溶血弧菌在TCBS上的典型菌落為綠色或藍(lán)綠色、圓形、半透明、邊緣整齊、濕潤(rùn)且有粘稠感，在科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上的典型菌落為紫紅色菌落。采集的103份樣品中，69份樣品在TCBS上呈綠色或藍(lán)綠色單菌落；這69份樣品中有42份在科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上呈紫紅色。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在用TCBS選擇培養(yǎng)基分離細(xì)菌的同時(shí)，還應(yīng)該增加科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基的分離步驟，這樣可以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。這主要是由于，盡管TCBS是一種選擇性培養(yǎng)基，但是在這種培養(yǎng)基上不只是副溶血弧菌會(huì)出現(xiàn)綠色或藍(lán)綠色菌落，其他的一些海洋弧菌，如創(chuàng)傷弧菌、霍利斯弧菌和擬態(tài)弧菌也會(huì)呈現(xiàn)綠色或藍(lán)綠色菌落[9]，但是這三種海洋弧菌在科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上的顏色分別是綠色、乳白色和綠色[10]，可以與副溶血弧菌的紫紅色明顯區(qū)分開[11]?？梢姡跈z測(cè)副溶血弧菌時(shí)，增加科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基分離的步驟可以排除其他一些弧菌的干擾。

2.2 革蘭氏染色和生理生化實(shí)驗(yàn)

將得到的42份可疑菌株進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果顯示，42份樣品在顯微鏡下觀察均為革蘭氏陰性細(xì)菌且呈短桿狀或弧狀，不規(guī)則分布。

鏡檢后的42份可疑樣品經(jīng)過初篩實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果表明，42份樣品在氧化酶實(shí)驗(yàn)中均為陽(yáng)性即先呈現(xiàn)粉紅色后變?yōu)轷r藍(lán)色，這與副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在無(wú)NaCl的胰胨水中不生長(zhǎng)，而在含NaCl濃度為3%、6%和10%的胰胨水中均生長(zhǎng)，且在3%和6%的NaCl的胰胨水中生長(zhǎng)較旺盛；在3%NaCl三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖，有動(dòng)力。經(jīng)過嗜鹽性實(shí)驗(yàn)和動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的42份樣品中，有2份樣品在含NaCl濃度為10%的胰胨水中不生長(zhǎng)，有2份樣品在3% NaCl三糖鐵瓊脂實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)H2S，不分解乳糖和葡萄糖。經(jīng)過初步鑒定實(shí)驗(yàn)，可以排除4份樣品，初步篩選出38份可疑樣品。對(duì)初篩后的38份可疑樣品進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)其結(jié)果顯示，除V-P實(shí)驗(yàn)（+/-為31/7）和蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（-/+為28/10）外，其他結(jié)果均與副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802相符合，根據(jù)復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[12]可知，38份可疑樣品均為副溶血弧菌。復(fù)篩菌株的生化鑒定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)副溶血弧菌的對(duì)比見表1。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 PCR擴(kuò)增groEL特異性基因 經(jīng)生化鑒定后的

38份副溶血弧菌樣品經(jīng)PCR鑒定均能擴(kuò)增出約500bp的目的條帶（見圖1），表明分離得到的38份樣品均為副溶血弧菌。

圖1 部分副溶血弧菌分離株的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of partial V.paraheamolyticus

表1 分離菌株的生化鑒定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)副溶血弧菌對(duì)比Table 1 Comparison of Vibrio paraheamolyticus seafood isolatswith type strain in biochemistry tests

2.3.2 16S rDNA檢測(cè)及同源性分析 分離得到的38份副溶血弧菌樣品根據(jù)本研究室的命名規(guī)則分別命名為：分離自藍(lán)圓鲹的IFS13001～I(xiàn)FS13003、多春魚的為IFS13004～I(xiàn)FS13008、鋸緣青蟹的為IFS13009～I(xiàn)FS13011、四角蛤蜊的為IFS13012～I(xiàn)FS13021、鮑魚的為IFS13022～I(xiàn)FS13025、青柳蛤的為IFS13026～I(xiàn)FS13031、縊蟶的為IFS13032～I(xiàn)FS13038。

圖2 部分副溶血弧菌分離株的16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 16S rDNA PCR products of partial V.parahaemolyticus isolates

上述38份分離株經(jīng)16S rDNA檢測(cè)均能擴(kuò)增出約1100bp的目的條帶（見圖2）。測(cè)序結(jié)果與NCBI上的副溶血弧菌序列對(duì)比，結(jié)果顯示分離得到的38份樣品與現(xiàn)有的副溶血弧菌序列普遍具有較高的同源性。用MEGA 5.0.5軟件（http：//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.htm l，http：//www.megasoftware.net/）中的Neighbour-Joining方法構(gòu)建了副溶血弧菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖3）?？梢钥闯?8株副溶血弧菌樣品大致可以分為兩組，其中同源性較高的樣品主要有：ISF13020和ISF13034、ISF13011和ISF13028、ISF13014和 ISF13024、ISF13023和 ISF13035、ISF13009和ISF13015等。

圖3 基于16S rDNA序列的副溶血弧菌分離株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of V.parahaemolyticus isolates based on 16S ribosomal DNA sequences

2.4 副溶血弧菌的檢出率

從103份海產(chǎn)品中檢出38株副溶血弧菌，其中藍(lán)圓鲹3株、多春魚5株、鋸緣青蟹3株、四角蛤蜊10株、鮑魚4株、青柳蛤6株和縊蟶7株，總檢出率高達(dá)37%，各樣品的檢出率見表2。

從表2中7種海產(chǎn)品的檢出率來看，貝類產(chǎn)品受副溶血弧菌的污染最為嚴(yán)重，其中四角蛤蜊的檢出率高達(dá)50%，青柳蛤檢出率達(dá)40%。因此，消費(fèi)者在食用這類產(chǎn)品時(shí)，切忌生食，一定要充分煮熟后食用。

本文采集樣品的時(shí)間是6～9月，正是副溶血弧菌生長(zhǎng)繁殖旺盛期，因此極具代表性。本研究結(jié)果顯示副溶血弧菌的檢出率為37%，與張?zhí)m榮等[13]報(bào)道的通州區(qū)超市、菜市場(chǎng)海產(chǎn)品中副溶血弧菌檢出率為35%相近，高于趙雪琴等[14]報(bào)道的2010年杭州市下城區(qū)副溶血弧菌24%的檢出率，低于江艷華等[15]報(bào)道的青島市售貝類副溶血弧菌的檢出率57.3%。與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的檢出率也存在一定的差異，如Paydar等[16]報(bào)道在馬來西亞海產(chǎn)品零售市場(chǎng)和大型綜合超市副溶血弧菌的檢出率為29%，Abd-Elghany等[17]報(bào)道在埃及曼蘇拉城市采集的120份海產(chǎn)品中副溶血弧菌的檢出率為16.7%。這可能是由于樣品采集的時(shí)間、地點(diǎn)和種類不同，導(dǎo)致檢出率的差異。

Molecular epidemiological investigation of Vibrio parahaemolyticus inseafoods surrounding coast of Bijiashan，Jinzhou

FAN Xiao-lin，ZHANG De-fu，F(xiàn)U Xu-lei，LIU Xue-fei，SUN Jia-ying，BAI Feng-ling，LI Jian-rong*
（Research Institute of Food Science，Bohai University，College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，F(xiàn)ood Safety Key Lab of Liaoning Province，Engineering and Technology Research Center ofFood Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

In order to investigate the Vibrio paraheamolyticus pollution status in seafoods of Bijiashan surroundingcoast，Jinzhou，one hundred and three seafoods were randomly sampled and then V. parahaemolyticus wereidentified according to the method of GB/T 4789.7-2008 combined with a PCR assay. Thirty-eight strains ofV. parahaemolyticus were isolated from samples with a detection rate of 37% ，which demonstrated thatseafoods of Bijiashan surrounding coast were seriously polluted by V. parahaemolyticus and the consumersmight encounter huge food safety hazards.

seafood ； Vibrio paraheamolyticus ； foodborn disease ； isolation and identification ； epidemiologicalinvestigation；PCR

TS201.6

：A

：1002-0306（2014）16-0049-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.001

2013-12-19 *通訊聯(lián)系人

樊曉琳（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食源性病原微生物的檢測(cè)、控制及致病機(jī)理。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD29B06）；遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（LNSAKF2013018，LNSAKF2011040）；渤海大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（BSQD022）。