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（1. 山西省陽泉市農(nóng)業(yè)委員會，山西陽泉　045000；2. 山西省動物疫病預防控制中心，山西太原　030027； 3.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春　130062 ）

布魯氏菌實時定量熒光PCR檢測體系的建立及應用

石麗瑞1，李秀華1，韓惠瑛2，孟日增3

（1. 山西省陽泉市農(nóng)業(yè)委員會，山西陽泉045000；2. 山西省動物疫病預防控制中心，山西太原030027； 3.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春130062 ）

本根據(jù)GenBank上公布的布魯氏菌BCSP31基因保守區(qū)域序列設(shè)計合成一對特異性引物與TapMan探針，建立整套快速準確鑒定布魯氏菌的實時定量熒光PCR檢測體系。以實驗室構(gòu)建的克隆有布魯氏菌目的片段的重組質(zhì)粒為標準品，進行實時定量熒光PCR反應檢測，通過優(yōu)化反應條件，建立標準曲線。以標準品為模板，對該方法的特異性、敏感性與重復性進行檢測與分析。并以臨床樣本進行檢測的結(jié)果進行比較分析，結(jié)果表明，該檢測體系的檢測靈敏度高，重復性與特異性良好。本研究建立的實時定量熒光PCR可用于準確檢測樣本中的少量的布魯氏菌，具有良好的應用前景和市場價值。

布魯氏菌；實時定量熒光PCR； 樣本檢測

布魯氏菌病（又稱馬耳他熱）是一種人畜共患傳染病，最早對于該病的報道源于19世紀[1-4]。布魯氏菌主要包括6個種屬 （羊、牛、豬、犬、綿羊和沙林鼠種布魯氏菌），其中，牛、羊、豬、犬種布魯氏菌為主要的人畜共患菌種[5]。感染該病的典型特征是生殖器官產(chǎn)生炎癥、流產(chǎn)、早產(chǎn)、不孕不育等一系列的生殖系統(tǒng)疾病[6-7]。由于布魯氏菌病隱性病例多，臨床上大多不具有明顯癥狀，往往造成對本病的忽視。此外，目前此病并無特效藥，對該病以防控為主，因此對該病的檢驗檢測顯得尤為重要。目前，對該病菌（布魯氏菌）的主要檢測手段包括兩個方面：一是血清學檢測，包括沉淀反應、補體結(jié)合反應和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等；二是分子生物學手段，包括DNA 探針和PCR檢測。前者適用于大規(guī)?？焖贆z測，后者適用于定性檢測。因此本研究致力于建立敏感、準確的布氏桿菌實時定量熒光PCR檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料不同種屬的布魯氏菌菌種購自中科院或由本單位保存；對照菌株等均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；疑似布魯氏菌病的血液或組織樣品由吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心協(xié)助采集；引物和探針由上海生工合成與制備；蛋白酶試劑均為Sigma公司產(chǎn)品；如無特殊說明，其它相應化學試劑（分析級）均購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1目的基因的確定、引物設(shè)計與合成

通過大量查閱文獻及資料，并在GenBank搜索相應核酸序列，針對布魯氏菌基因序列，選取布魯氏菌膜外蛋白BSCP31基因的特異性保守區(qū)段設(shè)計特異性引物及探針：上游引物5'-GTTAATACCAAATATATCCCTGA-3’， 下 游引物5'-TCTGCGTCATAAAGCATTC-3’，探針FAM-TGCAGCCTCCACCGGGATGC-TAMRA，均配制成20 μmol/L，-20 ℃保存。設(shè)計好的引物及探針交由上海生工合成與制備。

1.2.2樣本DNA提取與制備

1.2.2.1材料處理取新鮮制備（通過培養(yǎng)布魯氏菌獲得）或冰凍臨床樣本（來自于疑似病例組織或血液）處理組織塊0.5～1.0cm3， 并用剪刀剪碎，然后加TE 1mL，并進行勻漿。將勻漿液倒入到2mL離心管中。然后加入20% SDS 25 mL，蛋白酶K （2mg/mL） 25 mL進行消化組織，60°C水浴2.5～3h。

1.2.2.2DNA提取按照常規(guī)方法進行，大致過程如下： 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，混和、充分混勻3min， 5000g離心10min，取上層水相到另一1.5mL離心管中。加等體積飽和酚，混勻， 5000g離心10min，取上層水相到另一管中。加等體積酚/氯仿，輕輕混勻， 5000g離心10min，取上層水相到另一管中。加等體積氯仿，輕輕混勻，5000g離心10min，取上層水相到另一管中。加1/10體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。待絮狀物出現(xiàn)后， 5000g離心5min，棄上清液。沉淀用75%乙醇洗滌， 5000g離心3min ，棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50～100mL TE溶解過夜。此外，在提取DNA的過程中我們也曾采用商品化的基因組DNA提取試劑盒抽提布魯氏菌全基因DNA，二者無明顯差異。

1.2.2.3模板DNA制備與提取選取引起布魯氏菌病的2株不同基因型的布魯氏菌懸液以10000r/m離心2min，棄上清，向沉淀中加入560μLTE緩沖液，反復吹打使之重懸，加入30μL的10% SDS和3μL蛋白酶K（20mg/mL），混勻，37℃孵育1h；加入100μL 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80μL CTAB/ NaCl溶液，混勻，65℃溫育10 min；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)入一新離心管中；加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀，10000 r/min離心15min，去上清；75%乙醇洗一次，去上清，干燥，加入50μL的TE緩沖液溶解DNA備用（如不能及時檢驗，可將上清液于-20 ℃保存；-70 ℃可長期保存）。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測方法的建立為獲得最低Ct值、典型熒光擴增曲線和較高熒光強度的引物和探針最佳濃度，測定提取細菌，選取40 ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL、120ng/ mL 5組濃度；引物、探針濃度：1μM/0.5μM、5μM/2.5μM、10μM/5μM、20μM/10μM，用矩陣法篩選引物和探針的最佳使用量。選定60 ng/mL核酸濃度和10μM/5μM引物探針濃度。

1.2.3.125μL反應體系TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL；上游引物（10μmol/L）1μL；下游引物（10μmol/L） 1μL；探針（5μmol/L） 1μL；DNA，5μL；ddH2O 4.5μL。

1.2.3.2反應條件根據(jù)實驗的需要設(shè)計兩個反應階段：第一階段95℃ 15min；第二階段94℃ 10s、62℃45s，40個循環(huán)；熒光收集設(shè)置在62℃ 45s時進行。

1.2.4特異性試驗

應用建立的熒光定量PCR方法檢測牛副結(jié)核分支桿菌、大腸桿菌、鏈球菌DNA，并設(shè)立ddH2O作為陰性對照，檢測引物和探針的特異性。

1.2.5敏感性與重復性試驗

將核酸進行10倍系列稀釋，用熒光定量PCR測定方法的敏感性。對同一陽性樣品的4個不同稀釋度進行3次重復熒光PCR檢測，通過組內(nèi)重復和組間重復的熒光擴增曲線及Ct值變化來評估方法的重復性。

1.2.6臨床樣本的檢測

從送檢的樣品中抽取30份進行檢測，以驗證建立的熒光定量PCR方法的有效性。

2　結(jié)果

2.1反應體系條件

為了建立良好的實時定量熒光PCR的反應體系，并通過一系列條件的摸索與鑒定，確定了熒光定量PCR的檢測體系，結(jié)果如圖1所示。

圖1　反應程序的確立

2.2特異性實驗結(jié)果

為了驗證所建實時定量熒光PCR方法的特異性，我們進行了交叉檢測實驗。結(jié)果表明， 運用本體系檢測牛副結(jié)核分支桿菌、大腸桿菌、鏈球菌DNA等結(jié)果均為陰性，只有布魯氏菌檢測結(jié)果呈現(xiàn)陽性（圖2），這表明，建立的實時定量熒光PCR方法的表現(xiàn)出良好的特異性。

圖2　特異性實驗結(jié)果

2.3重復性與敏感性實驗結(jié)果

為了驗證所建實時定量熒光PCR方法的可靠性與重復性，進行了多樣本多次檢測，結(jié)果表明，該方法檢測準確性高，重復性好。此外，該檢測體系也表現(xiàn)出了良好的敏感性，最低可檢測到的下限水平相當于每微升2.0×101拷貝數(shù)的標品（圖3、4）。

圖3　敏感性試驗

圖4　重復性試驗

2.4臨床樣品檢測

為證實所建熒光定量分析體系的準確性，我們對采集的樣品進行檢測，檢測結(jié)果與已知結(jié)果比較表明檢測符合率為100%。結(jié)果表明該方法特異性、重復性、準確性均較好，適合用于布魯氏菌檢測。

3　討論

布魯氏菌屬（Brucella）又稱布氏桿菌，屬于革蘭氏陰性的短小桿菌。該菌分為羊、牛、豬、鼠、綿羊及犬種布魯氏菌6個種，其中，羊、牛、豬等動物最易感染該病，并容易引起流產(chǎn)等一系列嚴重后果[1-2，8-10]。人類也可以通過接觸帶病動物產(chǎn)品等感染此病。布魯氏菌病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展造成重大的經(jīng)濟損失。

我國部分地區(qū)曾有流行，特別是在50—60年代，現(xiàn)已基本控制。中國流行的主要是羊種、牛種和豬種三種布魯氏菌，其中以羊種布魯氏菌病分布最為廣泛。我國是該病的高發(fā)國家，特別是青海、新疆、內(nèi)蒙過及西藏等地。該病并無特效藥，有效的檢測和預防是防控本病的重中之重。因此，研究快速準確并適合臨床檢測的技術(shù)尤為重要。國內(nèi)外學者也在這方面做了大量的努力，開發(fā)了大量的診斷本病的方法，主要包括以下幾個方面：（1）病原學檢測：本病的病原體的分離培養(yǎng)被認為是本病的黃金標準。這種方法也被認為診斷該病最為可靠的方法。但是這種方法，不僅費時，而且危險，因為需要培養(yǎng)活菌[11-14]。因此，該方法不適合作為普遍的檢測方法；（2） 血清學檢測：該方法是診斷布魯氏菌的主要方法，有平板凝集試驗、補體結(jié)合試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等[15-17]，但是血清學檢測特異性不強、敏感性差或操作煩瑣等缺點。近年來有很多分子生物學方法用于布魯氏菌檢測，包括聚合酶鏈式反應（PCR），該方法特異性強，敏感性高，并可以用于定性試驗。1997年，Mari A等報道建立PCR快速診斷方法[3，18-29]，結(jié)果表明該方法特異性高。自此以后，一系列的研究報道使用PCR方法診斷與檢測布魯氏菌。但是，隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了熒光定量PCR技術(shù)。

在本研究中，我們根據(jù)布氏桿菌的保守基因設(shè)計引物并合成探針，并建立了熒光定量的分析體系，該檢測體系準確性高、重復性好，并表現(xiàn)出了良好的檢測敏感性，這說明該檢測體系具有良好的潛在應用價值。

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Establishment and application of real-time fl uorescence quantitative PCR system for the detection of Brucella spp

Shi Lirui1，Li Xiuhua1，Han Huiying2，Meng Rizeng3
（1.Yangquan City Agriculture Commission，Yangquan， Shanxi 045000；2.Shanxi Province Animal Disease Prevention and Control Center，Taiyuan， Shanxi 030027；3.Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changchun， Jilin 130062）

According to the conserved sequences of Brucella BCSP31 genes， a pair of specif i c primers and probe were designed and synthesized to establish a rapid and accurate detection system for identif i cation of Brucella by real-time quantitative PCR assay. The prepared Brucella recombinant plasmid containing target gene fragment was taken as the standard in the real-time quantitative fl uorescent PCR， and the standard curve was then established. The specif i city，sensitivity and reproducibility of this detection system were determined with standard as template. Comparison of clinical samples and standard samples showed that the PCR system was of high sensitivity， reproducibility and specif i city. In conclusion， the study established real-time quantitative fl uorescent PCR assay which could be used to detect small amount of Brucella in sample， with sound applicable prospect and quite good market value.

Brucella； real time fl uorescent quantitative PCR； sample detection

S852.614

：A

：1005-944X（2014）01-0057-04