，，，，

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆烏魯木齊 830000；3. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊 830000）

用多重PCR方法檢測(cè)奶牛場(chǎng)麻雀中分枝桿菌感染情況

周方永1，蔣業(yè)慧1，梁俊明2，李 巖3，馬 勛1

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆烏魯木齊830000；3. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊830000）

目的利用可以鑒別分支桿菌屬中結(jié)核分枝桿菌、牛分支桿菌、非結(jié)核分枝桿菌多重PCR方法，檢測(cè)奶牛場(chǎng)麻雀組織中分支桿菌感染情況。方法根據(jù)結(jié)核分枝桿菌種特異基因目的片段MTP40、分枝桿菌屬特異基因32kD、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異基因IS6110插入序列，設(shè)計(jì)合成三對(duì)特異性引物，擴(kuò)增對(duì)32kD的506bp、MTP40的396bp和IS6110的984bp片段，以此方法檢測(cè)奶牛場(chǎng)麻雀肺組織中分支桿菌感染情況，并對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的目的片段進(jìn)行克隆測(cè)序。結(jié)果在分析的21份麻雀肺組織中，檢測(cè)出2例非結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性病料，陽(yáng)性率9.52%。2例陽(yáng)性樣本PCR擴(kuò)增得到的片段與GenBank收錄的32kD基因同源性分別為95.8%和97.2%。結(jié)論麻雀肺組織中存在分支桿菌感染陽(yáng)性病例提示該牛場(chǎng)中生物體內(nèi)存在分支桿菌潛伏感染，并可能導(dǎo)致奶牛的潛伏感染以及干擾結(jié)核檢疫。

奶牛場(chǎng)；分枝桿菌；麻雀；多重PCR

目前國(guó)內(nèi)外牛結(jié)核的檢疫方法主要是皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，檢疫所應(yīng)用的診斷試劑PPD是多種抗原的混合物，所含的抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及BCG所共有，由于交叉反應(yīng)的存在，其非特異性檢出在所難免[1]。有研究表明，接觸“環(huán)境”分枝桿菌對(duì)此后接觸致病性分枝桿菌時(shí)的免疫應(yīng)答性質(zhì)有明顯作用[2]，出現(xiàn)結(jié)核檢疫的皮試假陽(yáng)性的原因與牛、養(yǎng)殖場(chǎng)周圍的生物以及環(huán)境中其他結(jié)核桿菌及非結(jié)核桿菌的攜帶情況有關(guān)。

分枝桿菌廣泛分布于環(huán)境之中，可從土壤、水、植物和糞便中分離到。奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)周圍的分枝桿菌的分布與周圍的生物以及環(huán)境中細(xì)菌的攜帶情況有關(guān)。雞最易感染，鴨、鵝和鴿等都能感染，其他鳥類也有攜帶并感染的報(bào)道，主要通過(guò)含病菌的糞便及分泌物污染土壤、墊草、用具、飼料和飲水，健康牛吞食后而受感染。雞蛋、野禽（孔雀、麻雀、燕子、雉、烏鴉、貓頭鷹等）也能傳播分枝桿菌[3]。了解奶牛場(chǎng)周圍生物分枝桿菌的攜帶情況對(duì)防控奶牛分枝桿菌感染和分枝桿菌溯源具有重要意義。

1 材料

1.1標(biāo) 準(zhǔn)菌種 結(jié)核分枝 桿菌H37Ra國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)無(wú)毒株、卡介苗（BCG）取自石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原室；龜分枝桿菌（MC）、大腸桿菌（DH5α）為本實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)保存； 禽分枝桿菌（MAP）、胞內(nèi)分枝桿菌（MAC）、偶發(fā)分枝桿菌（MF）、恥垢分枝桿菌（MS）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)郭愛珍教授惠贈(zèng)。

1.2主要試劑與材料 Marker 2000bpDNA ladders、TaqDNA 聚合酶購(gòu)自東盛公司；DNA膠回收試劑盒、組織總DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PMD-19-T載體（TIANGEN公司）；PCR引物由北京華大基因合成；改良羅氏培養(yǎng)基、蘇通液體培養(yǎng)基。

1.3臨床標(biāo)本的來(lái)源 麻雀21只，于奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)結(jié)核檢疫過(guò)程中抓捕所得，封袋分裝，詳細(xì)標(biāo)記，送至實(shí)驗(yàn)室-20℃保存。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成：

根據(jù)GenBank中登錄的結(jié)核分枝桿菌種特異基因目的片段MTP40（結(jié)核分枝桿菌種特異基因）、32kD（分枝桿菌屬特異基因）、IS6110插入序列（結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異基因）[4]，設(shè)計(jì)合成三對(duì)特異性引物PT1，PT2；MT1，MT2；IS5，IS6（表1）。

表1引物設(shè)計(jì)

2 方法

2.1細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株的培養(yǎng)

將禽結(jié)核桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、龜分枝桿菌接種至改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)。禽分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌屬緩慢生長(zhǎng)菌，培養(yǎng)周期4周左右可用于實(shí)驗(yàn)；龜分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌屬快速生長(zhǎng)菌，培養(yǎng)24h即可用于實(shí)驗(yàn)[5]。大腸桿菌接種于 LB液體培養(yǎng)基中，180r/min，37℃恒溫培養(yǎng)24h。

2.2模板的制備：

2.2.1細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株模板的提取

采用水煮法制備細(xì)菌DNA模板，具體過(guò)程參見沈德新等[6]關(guān)于細(xì)菌DNA的提取方法。

2.2.2麻雀肺臟組織DNA的提取

2.2.2.1樣品前處理

解剖麻雀，無(wú)菌取肺臟組織，用手術(shù)剪將組織剪碎后，于勻漿器中研磨組織至液化。組織懸液用4倍體積4%NaOH作用15min左右，除掉雜菌；再用HCl中和，12000r/min離心5min，棄上清液，向沉淀中加入無(wú)菌ddH2O，再次離心棄上清，收集沉淀備后期試驗(yàn)用。

2.2.2.2肺組織DNA的提取

參照組織、血液、細(xì)胞DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.3多重PCR反應(yīng)及檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為25μL的 PCR 反應(yīng)體系：Taq酶 0.5μL、10*PCR buffer 2μL、10mM DNTPs 2μL、模板DNA 2μL、上下游引物各1μL，加水至25μL。陰性對(duì)照以大腸桿菌代替模板。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性5min； 94℃變性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

反應(yīng)結(jié)束，分別取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.4多重PCR特異性試驗(yàn)

利用建立的多重PCR同時(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Ra、卡介苗、禽分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、龜分枝桿菌和陰性對(duì)照菌株大腸桿菌（DH5α）進(jìn)行擴(kuò)增，確定方法的特異性。

2.5多重PCR敏感性試驗(yàn)

將提取的結(jié)核分枝桿菌H37Ra總DNA，用核酸測(cè)定儀確定其濃度為3.3ng/μL，然后從3.3 ng開始按10倍遞增稀釋至10-6，各取2μL，進(jìn)行多重進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳圖譜，確定方法的敏感性。

2.6多重PCR方法的臨床檢測(cè)

利用建立的分枝桿菌多重PCR方法擴(kuò)增麻雀肺組織DNA中的目的基因片段，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、成像觀察擴(kuò)增結(jié)果。

2.7目的基因片段的克隆測(cè)序

2.7.1目的基因的回收

利用天根公司膠回收試劑盒回收目的基因，具體步驟參見試劑盒說(shuō)明書。

2.7.2目的基因與載體連接：

按pMDTM19-T戴體說(shuō)明書進(jìn)行（表2），向體系中加入Solution I 5μL（等量），16℃過(guò)夜反應(yīng)。

表2連接體系

2.7.3連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

將-80℃凍存的感受態(tài)細(xì)胞取出置冰上融化后，吸取100μL于1.5mL無(wú)菌EP管內(nèi)，加入連接產(chǎn)物（約5～10μL）混勻，冰浴30min，42℃水浴熱擊90s（熱激），再置冰上2min（冷激），加入400μL LB液體培養(yǎng)基，37℃200r/min搖床振蕩培養(yǎng)45min。離心后留100μL培養(yǎng)液，用滴頭吹打使菌體懸浮，將菌液涂于AMP平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果。

2.7.4AMP抗性篩選

挑取AMP抗性培養(yǎng)基中的單菌落，轉(zhuǎn)接入空白的AMP抗性平板，為了增加陽(yáng)性篩選率，盡可能多挑取單菌落數(shù)，分別標(biāo)記完整，密封。置溫箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24h。

2.7.5菌液PCR鑒定

滴頭挑取少量擴(kuò)大培養(yǎng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子入PCR管中，以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

2.7.6陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒抽提

采用天根UNIQ-10 柱式質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行提取，送六合華大基因公司測(cè)序。

3 結(jié)果與分析

3.1多重PCR的特異性試驗(yàn)

結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、龜分枝桿菌、禽分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌均能擴(kuò)增出各自的目的條帶，大腸桿菌未擴(kuò)增出特異性條帶（圖1）。

圖1 引物特異性試驗(yàn)結(jié)果

3.2多重PCR敏感性試驗(yàn) 在25μL體系中， 3對(duì)引物的終濃度均為0.2μmol/L，多重PCR敏感性為10-6ng（圖2）。

3.3麻雀組織中分枝桿菌多重PCR反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)經(jīng)過(guò)前處理的麻雀肺臟組織總DNA進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，在21份肺組織樣品中，未檢測(cè)出牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌感染者，有2（泳道4和12）份呈非結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性（圖3），檢出率為9.52%。

3.4擴(kuò)增片段的克隆測(cè)序結(jié)果

將目的基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast對(duì)比，結(jié)果表明所得到的片段與GenBank收錄的32kD基因同源性分別為95.8%和97.2%。

圖2多重PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖3多重PCR反應(yīng)麻雀檢測(cè)結(jié)果

4 討論

非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculous Mycobacterium，NTM）廣泛存在于自然環(huán)境中，土壤、水源、草皮、糞便、動(dòng)植物表面等都可以分離到NTM[7]，在我們?nèi)粘ｏ嬘玫呐Ｄ獭⒆詠?lái)水中也有分離到NTM的報(bào)道[8-9]，在1988年和1997年美國(guó)就曾經(jīng)報(bào)道從321份生活用水中分離出80株戈登分枝桿菌和47株鳥分枝桿菌[10-11]， 2008年上海市疾控中心陳超等從上海市48份自來(lái)水樣中分離出了戈登分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌[12]。NTM感染動(dòng)物體后，其臨床癥狀、細(xì)菌涂片染色檢查、X線檢查等方法很難與結(jié)核分枝桿菌病相區(qū)分[13]，導(dǎo)致很多NTM病被誤診為結(jié)核病，同時(shí)NTM還能對(duì)結(jié)核、副結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)產(chǎn)生陽(yáng)性或假陽(yáng)性反應(yīng)，而影響動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫工作的進(jìn)行。非結(jié)核分枝桿菌感染多發(fā)生于育成?；蚯嗄昱14-15]，而且多呈一次性結(jié)核變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性。2005年，深圳慢性病防治院林世平等[16]從174份牛鼻腔分泌物中分離出分枝桿菌88株，陽(yáng)性率為50.5%，其中草分枝桿菌20株、偶然分支桿19株、戈登分枝桿菌17株、不產(chǎn)色分枝桿菌13株、土分枝桿菌9株、龜膿腫分枝桿菌 8株和鳥胞內(nèi)分枝桿菌2株。Hejlicek K等[17]在1966-1990年間對(duì)3210只野鳥進(jìn)行了結(jié)核病調(diào)查，在5次野鳥病例中都分離到了禽分枝桿菌。1984年P(guān)ortaels F等[18]對(duì)27種野鳥的分枝桿菌感染狀況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果分離到1株分枝桿菌，經(jīng)對(duì)分離菌16S RNA基因序列分析表明是日內(nèi)瓦分枝桿菌（M.genavense）。HoopR K[19]報(bào)道了金絲雀和鸚鵡感染了分枝桿菌所引發(fā)的的結(jié)核病，而且在金絲雀肺臟上見有明顯結(jié)核病灶。本試驗(yàn)所用麻雀為結(jié)核檢疫牛場(chǎng)中捕捉所得，無(wú)菌操作取肺臟，經(jīng)研磨后分別進(jìn)行染色鏡檢、接種分離培養(yǎng)、多重PCR鑒定。結(jié)果21只麻雀肺組織涂片抗酸染色鏡檢與培養(yǎng)均未獲得陽(yáng)性結(jié)果，多重PCR方法成功擴(kuò)增出2例非結(jié)核分枝桿菌，陽(yáng)性檢出率為9.52%，提示該牛場(chǎng)中生物體內(nèi)存在分枝桿菌潛伏感染，并可能導(dǎo)致牛的潛伏感染以及干擾結(jié)核檢疫。本試驗(yàn)所建立的多重PCR具有高度的特異性和敏感性，并能同時(shí)檢測(cè)并鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌DNA，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中目的片段的數(shù)量，靈敏、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出臨床病料中分枝桿菌感染情況。

[1] Buddle B M. Use of east-6 in the IFN-? test needs for evaluating antituberculosis vaccines[J]. Vet Microbiol， 2001，80（1）：37-46.

[2]陳全. 用抗原診斷結(jié)核分枝桿菌感染的免疫學(xué)研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2004，25（5）：456-458.

[3]李金嶺，徐青元，周宇等.排除牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)中禽結(jié)核干擾的研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008，30（3）：352-355.

[4]孟祥紅，匡鐵吉，董梅.應(yīng)用多重PCR方法快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32（11）：1177-1178，1183.

[5]中國(guó)防癆協(xié)會(huì).結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國(guó)防癆雜志，1996，18（1）：28-31.

[6]沈德新，封志純，杜江.細(xì)菌DNA提取方法比較 [J].中原醫(yī)刊，2004，31（10）：21-22.

[7]馬秀玲.非結(jié)核分枝桿菌的研究現(xiàn)狀[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002（6）：897-899.

[8] Porteous N B， Redding S W， Jorgensen J H. Isolation of non-tuberculosis mycobacteria in treated dental unit waterlines[J]. Oral Surgery， Oral Medicine， Oral Pathology，Oral Radiology， and Endodontology，2004， 98（l）：40-44.

[9] Vaerewijck M J M， Huys G， Palomino J C， et al. Mycobacteria in drinking water distribution systems： ecology and significance for human health[J]. FEMS Microbiol Rev，2005，29（5）：911-934.

[10] Jie T， Matas A J， Gillingham K J， et al. Mycobacterial Infections After Kidney Transplant[J]. Transplantation Proceedings， 2005，37（2）：937-939.

[11] Simor A E， Salit I E， Vellend H. Authors’ response[J]. Clin Microbiol Newsletter，1988，10（14）： 111-112.

[12]陳超，徐鵬，李靜，等.城市生活飲用水中非結(jié)核分枝桿菌調(diào)查[J].微生物與感染，2008，3（4）：215-218.

[13] Griff i th D E， Brown-Elliott B A， Wallace R J. Diagnosing non-tuberculous Mycobacterial lung disease： A process in evolution[J]. Infectious Disease Clinics of North America，2002，16（l）：235-249.

[14] Gradon J D， Lutwick L， Lueas S B. Tuberculosis lymphadenopathy and HIV[J] The Lancet，1991，337（8738）：427-429.

[15]張宇，王鐵峰，錢愛東.豬、牛源非結(jié)核分枝桿菌的分離與鑒定[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2010，31（7）：10-14.

[16]林世平，楊應(yīng)周，譚衛(wèi)國(guó)，等.牛鼻腔分泌物非結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)結(jié)果分析[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2005，5（6）：1207-1209.

[17]Hejlicek K， Treml F. The occurrence of avian mycobacteriosis in wild birds during various epizootic conditions of tuberculosis in poultry[J].Vet Med（Praha）， 1993，38（5）：305-317.

[18]Portaels L， Realini L， Bauwens L， et al. Mycobacteriosis caused by Mycobacterium genavense in birds kept in a zoo： 11 year survey[J].J Clin Microbiol，1996，34（2）：319-323.

[19]Hoop R K. Mycobacterium tuberculosis infection in a canary（Serinus canana L.） and a blue-fronted Amazon parrot（Amazona aestiva）[J].Avian Dis，2002，46（2）： 502-504.

Detection of Mycobacterium in Sparrow Tissues in a Dairy Cattle Farm with Multiplex PCR Assay

Zhou Fangyong1，Jiang Yehui1，Liang Junming2，Li Yan3，Ma Xun1
（1. College of Animal Science and Technology，Shihezi University， Shihezi 832000 ；2.Animal Husbandry and Veterinary Station Twelfth Division of Xinjiang Production and Construction Corps Urumqi 83000； 3. Animal husbandry and veterinary work Terminus of Xinjiang Production and Construction Corps Urumqi 830000）

ObjectiveTo detect the Mycobacterium infection in the tissues of sparrows in a dairy cattle farm with a multiplex PCR assay that can discriminate Mycobacterium tuberculosis，Mycobacterium bovis，and non-tuberculous mycobacteria.MethodThree pairs of primers were designed and synthesized based on the specif i c genes of Mycobacterium tuberculosis （MTP40），the specif i c genes of Mycobacterium（32kD），and the specif i c genes of Mycobacterium tuberculosis complex（IS6110），and used in a multiplex PCR assay for amplif i cation of the 506bp gene of 32kD，the 396bp gene of MTP40，and the 984bp gene of IS6110. The assay was carried out to detect the Mycobacterium infection in sparrow lung tissue in a dairy cattle farm and the positive fragments were cloned and sequenced.Result2 of 21 sparrow lung tissue samples were positive for non-tuberculous mycobacteria with a positive rate of 9.52%. The homology of the 2 positive samples with the 32kD gene in GenBank was 95.8% and 97.2% respectively.ConclusionThe presence of mycobacterial infection in sparrow lung tissues suggested that organisms in the dairy cattle farm had been latently infected with Mycobacterium， possibly causing latent infection with Mycobacterium and thus interfering with TB tests.

Dairy cattle farm； Mycobacterium； Sparrow； Multiplex PCR

S852.618

：A

：1005-944X（2014）01-0081-05

國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2012BAD43B02）

馬 勛