王慧瑩，楊棟梁，劉佳佳，孫振宇，劉 昶，劉 雄

（中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410083）

多穗柯（Lithocarpus polystarch）又名甜茶，是一種藥食兩用、兼有茶、糖、藥3種功能的植物，是一種適應(yīng)性比較強(qiáng)的速生樹種[1]。多穗柯的嫩葉因二氫查耳酮含量豐富而具有清爽的甜味，甜味成分主要是根皮苷、三葉苷和3-羥基根皮苷等二氫查爾酮苷類[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Whanchul等[3]對(duì)具有甜味的二氫查耳酮的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)分子結(jié)構(gòu)中2羥基與羰基形成分子內(nèi)氫鍵時(shí)，常常具有很強(qiáng)烈的甜味，且是蔗糖的幾百倍以上。Tsujihara等[4]以根皮苷為前體合成的4-甲氧基根皮苷對(duì)糖尿病有很強(qiáng)的抑制作用；研究報(bào)道，根皮素體外能夠抑制Molt-4人白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，體內(nèi)可以抑制Fisher膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；Kobori等[5-6]研究了根皮素致癌細(xì)胞死亡的機(jī)理。

多穗柯中二氫查耳酮含量豐富并且提取工藝較為簡(jiǎn)單，因此多穗柯的葉可以作為二氫查耳酮的來(lái)源植物加以利用。天然甜茶多穗柯中二氫查耳酮的提取方法已有國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道，但已有方法的最大弊端在于使用聚合氯化鋁作為絮凝劑。二氫查耳酮作為一種食品添加劑，鋁離子的殘余會(huì)對(duì)人體造成很大危害，長(zhǎng)期攝入過(guò)量的鋁會(huì)造成記憶力減退、注意力不集中、反應(yīng)遲緩甚至導(dǎo)致老年癡呆癥等疾病，這使二氫查耳酮甜味劑的保健作用失去意義。本實(shí)驗(yàn)采用殼聚糖作為絮凝劑，從根源上消除了鋁離子，成本較低、安全無(wú)毒并且絮凝效果更好。實(shí)驗(yàn)中用殼聚糖絮凝劑和聚合氯化鋁絮凝劑進(jìn)行對(duì)比，研究了殼聚糖作為絮凝劑的最佳用量和最優(yōu)條件，并用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖（分子量161.2） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR；聚合三氯化鋁 天津市大茂化學(xué)試劑廠，AR；根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品 SIGMA公司，HLPC≥98%；多穗柯葉（Lilhocarpus Polystachys Rehd） 于2012年4月采自湖南邵陽(yáng)，采后用水沖洗，葉片在烘箱中于50℃烘至手可捏碎，粉碎過(guò)篩，收集過(guò)100目篩部分，放置干燥處保存?zhèn)溆?，劉佳佳教授（中南大學(xué)）鑒定。

ME5-F型百萬(wàn)分之一電子天平 賽多利斯；Agilent 1100型高效液相色譜儀 安捷倫；UV2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城；CAV264C型精密電子天平、Starter 2C型酸度計(jì) 美國(guó)奧豪斯；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取物的制備 水提取法進(jìn)行浸提[7]（料液比1∶8）：多穗柯樣品于50℃干燥4.5h，精確稱取約30.0g，加入蒸餾水240m L，在80℃條件下提取60min，用紗布過(guò)濾，收集濾液平均分成3份；取一份直接抽濾檢測(cè)（即無(wú)絮凝劑），然后濃縮烘干測(cè)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。剩下2份分別用殼聚糖和聚合氯化鋁兩種絮凝劑進(jìn)行處理。

1.2.2 絮凝劑的選擇

1.2.2.1 殼聚糖絮凝劑 制取醋酸濃度為1.1%的醋酸溶液90m L。取1g殼聚糖，加入10m L去離子蒸餾水潤(rùn)濕、浸泡。15min后，將制好的醋酸溶液加入其中，攪拌直到殼聚糖溶解，再將溶液經(jīng)超聲（超聲功率為100W）處理20min，經(jīng)雙層紗布過(guò)濾，即得供實(shí)驗(yàn)用的殼聚糖絮凝劑。向多穗柯水提取液中以0.5m L（每g干藥）的比例加入殼聚糖絮凝劑，令提取液pH為6，溫度為25℃（室溫），以40r/m in攪拌60m in，抽濾[8]；再用分光光度儀分別測(cè)量其620nm處的吸光度，計(jì)算透光率（A=log1/T）和283nm處的吸光度，并計(jì)算二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.1.2 聚合氯化鋁絮凝劑 提取液中加入適量聚合氯化鋁，pH=7.5，溫度為60℃，靜置1h[9]，抽濾；再用分光光度儀分別測(cè)量其620nm處的透光率和283nm處的吸光度，并計(jì)算二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，并用蒸餾水準(zhǔn)確定容至50m L，搖勻。分別精密吸取根皮苷標(biāo)液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0m L于10m L容量瓶中，用蒸餾水定容，靜置30m in后搖勻，采用HPLC色譜測(cè)定，每次進(jìn)樣20μL，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度平行測(cè)定3次。

HPLC色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18（250mm×416mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈∶水=25∶75；體積流量：1m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm；柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20μL。

以根皮苷標(biāo)液質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)、峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

1.2.3.2 HPLC法計(jì)算二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù) 根據(jù)計(jì)算所得的線性回歸方程計(jì)算經(jīng)絮凝劑處理之后的提取液的二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：A為絮凝后的樣品在波長(zhǎng)283nm處的峰面積，A0為標(biāo)液在波長(zhǎng)283nm處的峰面積，ρ0為標(biāo)液的質(zhì)量濃度，L為絮凝之后的提取液體積。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 絮凝劑用量的影響 水提取液pH 6，絮凝時(shí)間60m in，溫度25℃，絮凝劑用量設(shè)定0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8m L六個(gè)水平梯度，考察絮凝劑用量對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

1.3.1.2 水提取液pH的影響 絮凝劑用量0.5m L/g（干藥），絮凝時(shí)間60m in，溫度25℃，水提取液pH設(shè)定5.0、5.5、6.0、6.5、7.0五個(gè)水平梯度，考察水提取液pH對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

1.3.1.3 絮凝時(shí)間的影響 絮凝劑用量0.5m L/g（干藥），水提取液pH6，溫度25℃，絮凝時(shí)間設(shè)定20、40、60、80、100m in五個(gè)水平梯度，考察絮凝時(shí)間對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

1.3.1.4 絮凝溫度的影響 絮凝劑用量0.5m L/g（干藥），水提取液pH6，絮凝時(shí)間60min，絮凝溫度設(shè)定20、25、30、35、40、45℃六個(gè)水平梯度，考察絮凝溫度T對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

1.3.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 應(yīng)用Design Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)的需要，對(duì)絮凝劑用量、水提取液pH、絮凝時(shí)間三因素進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

表1 三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1 Factor levels for the experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 不同絮凝工藝對(duì)提取液透光率及二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

表2中數(shù)據(jù)分別為使用殼聚糖絮凝劑、聚合氯化鋁絮凝劑和不使用絮凝劑得到的水提取液測(cè)得的透光率和計(jì)算所得的二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，相對(duì)于不使用絮凝劑，兩種絮凝劑的使用都提高了二氫查耳酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但數(shù)據(jù)表明殼聚糖絮凝劑優(yōu)于聚合氯化鋁絮凝劑。

表2 不同絮凝方法對(duì)提取液透光率及二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table2 Effectof different flocculation technologies on the light transmittance of thewater extractand themass fraction of dihydrogenchalcone

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 絮凝劑用量的確定 如圖1所示，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)同時(shí)隨絮凝劑用量的增加而增大，在0.5m L/g（干藥）時(shí)達(dá)最大值，但絮凝劑用量繼續(xù)增加，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)又同時(shí)減小。這是因?yàn)殡S著絮凝劑加入量的增加，吸附架橋和電中和作用增強(qiáng)，絮凝效果逐漸達(dá)到最佳值。但加入量過(guò)高時(shí)，藥液中的微粒易被殼聚糖包圍，失去其在顆粒間發(fā)揮的架橋作用，膠體表面發(fā)生2次吸附，微粒處于再穩(wěn)定狀態(tài)，黏度和濁度變高，也增加了對(duì)藥物有效成分的吸附。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳絮凝劑用量為0.5m L/g（干藥）。

圖1 絮凝劑用量對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effectof Flocculant dosage on themass fraction of dihydrogenchalcone

2.2.2 提取液pH的確定 如圖2所示，隨著提取液pH的增大，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)同時(shí)增大，在6.0時(shí)達(dá)最大值后又逐漸下降。這是因?yàn)闅ぞ厶鞘呛坊鶊F(tuán)的高分子長(zhǎng)鏈化合物，在偏酸性條件下，可很好地伸展其長(zhǎng)鏈，成為陽(yáng)離型，同時(shí)發(fā)揮吸附架橋和中和作用，以達(dá)澄清。但如果溶液的pH低于6時(shí)，二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低比透光率T620nm明顯，說(shuō)明可能pH對(duì)雜質(zhì)去除的影響較小，而對(duì)藥物成分含量的影響較大[10]。

2.2.3 絮凝時(shí)間的確定 如圖3所示，隨著絮凝時(shí)間的增加，高分子物質(zhì)與體系中膠體顆粒接觸概率增多，電中和、吸附架橋作用比較充分，體系的澄明度就增高，大約在60m in之后，絮凝完成，再繼續(xù)延長(zhǎng)絮凝時(shí)間，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本沒(méi)有變化。

圖2 水提取液pH對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effectof pH of the water extracton themass fraction of dihydrogenchalcone

圖3 絮凝時(shí)間對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect the period of the flocculation on themass fraction of dihydrogenchalcone

2.2.4 絮凝溫度的確定 如圖4所示，隨著溫度的升高，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較小幅度的提高，在溫度升高到35℃的時(shí)候達(dá)到最大，繼續(xù)升高溫度，透光率T620nm有小幅度的降低，但是二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻有明顯的降低。可能是因?yàn)殡S著絮凝溫度提高，體系內(nèi)膠體粒子熱運(yùn)動(dòng)的速度也逐漸增加，與膠體顆粒的碰撞頻率增加，電中和、吸附架橋作用比較充分，因此，絮凝比較徹底。但是當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，沉降的速度加快，絮凝劑對(duì)體系中剩余膠體顆粒的絮凝作用往往不夠充分，絮凝劑還有可能與產(chǎn)物發(fā)生了絮凝，使二氫查耳酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。本實(shí)驗(yàn)從可行性和經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇25℃（室溫）為最佳絮凝溫度[11]。

2.4 響應(yīng)曲面分析

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table3 The results of Box-Behnken experimental design

以絮凝劑用量、提取液pH和絮凝時(shí)間為三個(gè)可控工藝參數(shù)，二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法來(lái)優(yōu)化二氫查耳酮純化條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

利用Design-Expert軟件對(duì)17組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得絮凝劑用量（A）、提取液pH（B）和絮凝時(shí)間（C）與二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Y，%）的二次多元回歸模型，如公式所示：

如表4所示，三元二次方程的相關(guān)系數(shù)為0.9850，調(diào)整確定系數(shù)Ad j R2為0.9658，說(shuō)明該模型分別能解釋96.58%的響應(yīng)值變化[12]，說(shuō)明該模型擬合程度良好[13]，實(shí)驗(yàn)誤差小。通過(guò)回歸模型方差分析可以看出：F值為51.18，p＜0.0001，表明模型極其顯著。F值（F失擬）=22.60，p=0.057＞0.05，失擬項(xiàng)表明失擬不顯著。綜上所述，該模型可以用此模型對(duì)殼聚糖絮凝多穗柯水提液工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。對(duì)方程的回歸系數(shù)顯著性分析可知，A、B、C、A2、B2其p＜0.01，表明該幾項(xiàng)的影響有極顯著差異；AB、C2的p＜0.05，說(shuō)明該幾項(xiàng)的影響差異顯著；AC、BC其p＞0.05，表明這兩項(xiàng)無(wú)顯著影響[14]。因此，可以在α=0.05顯著水平對(duì)回歸模型進(jìn)一步的多元回歸分析，剔除其中的不顯著項(xiàng)，得到簡(jiǎn)化后的回歸模型，即：

F值可以反映各因素對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的重要性，F(xiàn)值越大表明對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響越大，即重要性越大。表4中，F(xiàn)A=140.3655，F(xiàn)B= 16.58616，F(xiàn)C=18.65753；即各因素對(duì)提取率影響程度的大小順序?yàn)椋篈＞C＞B即：絮凝劑用量＞絮凝時(shí)間＞提取液pH。

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的回歸二次方程，利用Design Expert軟件作絮凝劑用量、絮凝時(shí)間和提取液pH對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響的響應(yīng)曲面圖，分析兩個(gè)因素交互作用對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。從圖5可看出，在每組交互作用下，二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有最大值，因此說(shuō)明各組交互作用均對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有影響。但各圖中兩因素對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的大小只能通過(guò)方差分析得出，而不能僅依靠等高線的疏密度判斷。

表4 殼聚糖絮凝劑回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table4 Chitosan flocculant coefficientof the regression equation testof significance

圖5 不同自變量交互作用對(duì)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the interaction Effectof three independent variables on the content of dihydrogenchalcone

通過(guò)Design-Expert軟件分析，得到二氫查耳酮的純化最佳工藝：殼聚糖用量為0.54m L（每g干藥）（相當(dāng)于0.63g/L水提取液），pH為6.17，絮凝時(shí)間t為72.45min，該條件下二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測(cè)值為12.6562%。采取上述最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的情況，將二氫查耳酮的純化條件修正為殼聚糖用量為0.54m L（每g干藥）（相當(dāng)于0.63g/L水提取液），pH為6.17，絮凝時(shí)間為73min，因?yàn)闇囟葘?duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾乎沒(méi)有影響，故選擇25℃（室溫）作為絮凝溫度，實(shí)測(cè)二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.53%±0.07%。該值與理論最大值接近，說(shuō)明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化二氫查耳酮純化工藝可行[16]。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析對(duì)二氫查耳酮純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，各因素對(duì)提取率的影響大小為：絮凝劑用量＞絮凝時(shí)間＞提取液pH，結(jié)合實(shí)際操作，確定二氫查耳酮純化的最有條件是：絮凝劑用量為0.54m L（每g干藥）（相當(dāng)于0.63g/L水提取液）、pH為6.17、絮凝時(shí)間t為73m in、溫度為25℃，得到二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為12.53%，收率為83.53%，與傳統(tǒng)絮凝劑聚合氯化鋁比較（二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.3%，收率為80.13%），二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了33.76%，收率提高了4.01%。

實(shí)驗(yàn)后續(xù)還可以用ADS-7樹脂吸附分離，洗脫、濃縮、干燥，可得到較高純度的二氫查耳酮[17]。

天然高分子絮凝劑殼聚糖效果優(yōu)于傳統(tǒng)絮凝劑聚合氯化鋁，從源頭上排除了鋁離子殘余，安全無(wú)毒，用量也相對(duì)較少，因?yàn)闇囟葘?duì)絮凝效果影響不大，絮凝可在常溫下進(jìn)行，無(wú)需加熱節(jié)約能源。

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