張海鵬

[摘要] 目的 研究三氧化二砷（As2O3）聯(lián)合維A酸對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375的增殖、遷移能力影響及其可能的分子機(jī)制。 方法 常規(guī)培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞株A375，分為空白對(duì)照組（不含藥物的DMEM處理）、As2O3組（10 μmol/L As2O3）、全反式維A酸（at-RA）組（10 μmol/L at-RA）、As2O3+at-RA組（10 μmol/L As2O3聯(lián)合10 μmol/L at-RA）。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Western-blot法檢測(cè)MMP-2、Caspase-2的蛋白水平。 結(jié)果 ①As2O3+at-RA組的細(xì)胞活力為（35.8±7.3）%，低于As2O3組的（62.4±10.3）%和at-RA組的（59.3±11.3）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；②As2O3+at-RA組的遷移能力相對(duì)值為（21.3±6.3）%，低于As2O3組的（55.4±9.5）%和at-RA組的（57.1±10.4）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；③As2O3+at-RA組的Caspase-2蛋白含量為（274.1±42.4）%，高于As2O3組（175.2±29.4）%和at-RA組（181.4±23.8）%；As2O3+at-RA組的MMP-2蛋白含量為（36.2±8.2）%，低于As2O3組（64.2±10.4）%和at-RA組（62.7±9.4）%。 結(jié)論 As2O3和at-RA聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞株A375的增殖和遷移能力，這一作用可能是通過上調(diào)Caspase-2、下調(diào)MMP-2來發(fā)揮的。

[關(guān)鍵詞] 黑色素瘤；三氧化二砷；維A酸；增殖；遷移

[中圖分類號(hào)] R739.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）01（b）-0028-04

Effects of arsenic trioxide and retinoids on proliferation and migration of melanoma cell line A375 and its mechanism

ZHANG Haipeng

Department of Dermatological， Yuhang District Maternal and Child Care Service Centre， Zhejiang Province， Hangzhou 311100， China

[Abstract] Objective To study the effect of arsenic trioxide （As2O3） and retinoids on proliferation and migration of melanoma cell line A375 and its mechanism. Methods Melanoma cell line A375 were cultured and divided into vacuity contrast group （treated with DMEM）， As2O3 group （treated with 10 μmol/L As2O3）， at-RA group （treated with 10 μmol/L at-RA）， As2O3+at-RA group （treated with 10 μmol/L As2O3 and 10 μmol/L at-RA）. Then vitality was detected by MTT， migration was detected by wound-healing assay and protein level of MMP-2， Caspase-2 were detected by Western-blot. Results ①Cell vitality value of As2O3+at-RA group [（35.8±7.3）%] was lower than As2O3 group [（62.4±10.3）%] and at-RA group [（59.3±11.3）%]. ②Migration relative value of As2O3+at-RA group [（21.3±6.3）%] was lower than As2O3 group [（55.4±9.5）%] and at-RA group [（57.1±10.4）%]. ③Caspase protein level of As2O3+at-RA group [（274.1±42.4）% ]was higher than As2O3 group [（175.2±29.4）%] and at-RA group [（181.4±23.8）%]； MMP-2 protein level of As2O3+at-RA group [（36.2±8.2）%] was lower than As2O3 group [（64.2±10.4）%] and at-RA group [（62.7±9.4）%]. Conclusion As2O3 combined with at-RA can reduce the migration and proliferation ability of melanoma cell line A375， and down-regulation of MMP-2， up-regulation of Caspase-2 may be its possible molecular mechanism.

[Key words] Melanoma； Arsenic trioxide； Retinoids； Migration； Proliferation

黑色素瘤是一類具有高度惡性生物學(xué)行為的皮膚腫瘤，來源于皮膚基底部的黑色素細(xì)胞。近年來，我國(guó)的黑色素瘤發(fā)病率不斷升高，年發(fā)病例數(shù)已超過10 000例[1]。早期發(fā)現(xiàn)的患者可通過手術(shù)切除；中晚期患者則缺乏有效的治療手段，手術(shù)切除困難，化療效果不佳?；诤谏亓鲈鲋?、遷移等惡性生物學(xué)行為，探尋能夠抑制該生物學(xué)行為的治療方式具有積極的臨床應(yīng)用前景[2]。本研究通過培養(yǎng)惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375來分析三氧化二砷（As2O3）聯(lián)合維A酸對(duì)其增殖、遷移能力影響及其可能的分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375購買于中科院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購買于Gbico公司；抗體購買于Abcam公司；離心管和細(xì)胞培養(yǎng)板購買于Corning公司；全反式維A酸（at-RA）、As2O3等藥品購買于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)方法 將細(xì)胞從液氮罐中取出后迅速置于37℃水浴鍋中，并將細(xì)胞懸液移入15 mL離心管中，1000 r/min離心10 min，棄上清后用5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，移入培養(yǎng)瓶中在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿70%～80%且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰酶常規(guī)消化，傳代并接種于12孔板。

1.2.2 細(xì)胞處理方法 當(dāng)12孔板內(nèi)細(xì)胞鋪滿70%～80%后，將含血清的DMEM更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)24 h，而后分別用不含藥物的DMEM（空白對(duì)照組）、10 μmol/L As2O3（As2O3組）、10 μmol/L at-RA（at-RA組）、10 μmol/L As2O3聯(lián)合10 μmol/L at-RA（As2O3+at-RA組）處理。24 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.2.3 MTT法 藥物處理24 h后，小心吸去上清，加入160 μL DMEM培養(yǎng)基、40 μL 0.5%MTT溶液，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后吸盡上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜，置于搖床上低速振蕩10 min，而后在酶標(biāo)測(cè)儀上檢測(cè)490 nm處的吸光值，計(jì)算細(xì)胞活性。其中，以空白對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力為100%，分別計(jì)算As2O3組、at-RA組、As2O3+at-RA組細(xì)胞增殖能力的相對(duì)值。

1.2.4 劃痕試驗(yàn) 加藥處理同時(shí)用無菌的200 μL槍頭沿細(xì)胞孔中央在孔底部做一劃痕，于鏡下觀察并拍照記錄（0 h）；放回孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，而后取出培養(yǎng)板于鏡下觀察并拍照記錄（24 h）。所得圖像用Image J分析，計(jì)算0 h和24 h時(shí)劃痕的面積A0和A24，以（A0-A24）/A0反映細(xì)胞的遷移能力。其中以空白對(duì)照組細(xì)胞的遷移能力為100%，分別計(jì)算As2O3組、at-RA組、As2O3+at-RA組細(xì)胞遷移能力的相對(duì)值。

1.2.5 Western-blot法 在細(xì)胞孔內(nèi)加入60 μL蛋白裂解液RIPA，用細(xì)胞刮刀刮碎細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)，于4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清通過BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量，上樣量按每孔80 mg總蛋白計(jì)算。配置4%的濃縮膠和10%的分離膠，點(diǎn)樣后進(jìn)行100 V、20 min，120 V、90 min的垂直電泳和100 V、90 min的電轉(zhuǎn)膜。完成后取出NC膜投入5%脫脂牛奶中，室溫封閉2 h，而后在TBST溶液中震蕩洗滌5 min×3遍，根據(jù)分子量裁剪NC膜并分別加入2%BSA溶液配置的1∶1000的MMP-2、Caspase-9、actin第一抗體，4℃搖床孵育過夜。第2天取出NC膜，TBST溶液中震蕩洗滌5 min ×3遍，加入5%脫脂牛奶配置的1∶1000的HRP標(biāo)記的種屬特異行第二抗體、室溫孵育2 h后在TBST溶液中震蕩洗滌10 min ×3遍。最后進(jìn)行顯影。計(jì)算蛋白條帶的灰度值，以Tob灰度值/actin灰度值作為蛋白含量，令對(duì)照組的目的基因蛋白含量的均值為100%，計(jì)算As2O3組、at-RA組、As2O3+at-RA組的蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖能力

As2O3組、at-RA組、As2O3+at-RA組的細(xì)胞活力分別為（62.4±10.3）%、（59.3±11.3）%、（35.8±7.3）%，均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且As2O3+at-RA組的細(xì)胞活力低于 As2O3組和at-RA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1、圖1。

與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05；與As2O3+at-RA組比較，#P < 0.05

圖1 不同處理組A375細(xì)胞的細(xì)胞活力情況

2.2 細(xì)胞遷移能力

四組細(xì)胞0 h和24 h時(shí)的劃痕情況見圖2，As2O3組、at-RA組、As2O3+at-RA組的遷移能力相對(duì)值分別為（55.4±9.5）%、（57.1±10.4）%、（21.3±6.3）%，均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且As2O3+at-RA組的遷移能力相對(duì)值低于As2O3組和at-RA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 Caspase-2及MMP-2蛋白表達(dá)情況

As2O3組、at-RA組、As2O3+at-RA組的Caspase-2蛋白含量分別為（175.2±29.4）%、（181.4±23.8）%、（274.1±42.4）%，MMP-2蛋白含量分別為（64.2±10.4）%、（62.7±9.4）%、（36.2±8.2）%，均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；且As2O3+at-RA組的Caspase-2蛋白水平高于As2O3組和at-RA組，MMP-2含量低于As2O3組和at-RA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3、4、表1。

圖3 各組Caspase-2及MMP-2蛋白表達(dá)Western-blot條帶

與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05；與As2O3+at-RA組比較，#P < 0.05

圖4 各組Caspase-2及MMP-2蛋白表達(dá)相對(duì)值

表1 不同處理?xiàng)l件對(duì)細(xì)胞增殖能力、遷移能力以及蛋白含量的影響（%，x±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05；與As2O3+at-RA組比較，#P < 0.05

3 討論

As2O3是一類促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑，能夠通過促進(jìn)凋亡相關(guān)基因表達(dá)，抑制端粒酶活性，影響細(xì)胞周期蛋白含量，改變線粒體膜電位等來發(fā)揮促凋亡作用[3]。已有研究報(bào)道了As2O3具有誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的作用，其對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制率達(dá)到了50%～60%[4]。維A酸是維生素A在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物或衍生產(chǎn)物，包括全反式維A酸、13順維A酸、9順維A酸3種，對(duì)上皮組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等均起到調(diào)節(jié)作用[5]。目前的研究認(rèn)為，維A酸具有誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的作用，且以全反式維A酸的作用最為明顯，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率最高可達(dá)65%[6]。

盡管As2O3和維A酸能夠促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡，但在兩種藥物單獨(dú)應(yīng)用時(shí)并不能完全阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖過程，因而無法有效控制黑色素瘤的發(fā)展和浸潤(rùn)。國(guó)外Ribeiro等[7]的研究用As2O3和維A酸共同處理黑色素瘤細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種能夠在抑制腫瘤增殖和遷移方面發(fā)揮協(xié)同作用。近年來，國(guó)內(nèi)也逐步開展了關(guān)于黑色素瘤生物學(xué)行為方面的研究，張國(guó)強(qiáng)等[8]和牛新武等[9-10]分別報(bào)道了As2O3和維A酸對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用，但是關(guān)于兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用仍缺乏相關(guān)的研究。

本研究采用As2O3和維A酸共同處理黑色素瘤細(xì)胞株A375，探討其對(duì)腫瘤增殖、遷移能力的影響，并為臨床尋找有效的治療途徑提供參考。本研究中，分別通過MMT法和劃痕試驗(yàn)來檢測(cè)藥物處理后A375細(xì)胞株的增殖和遷移能力。由結(jié)果可知，As2O3組、at-RA組的增殖和遷移能力均低于空白對(duì)照組，這與其他研究的結(jié)果相一致，即As2O3和維A酸單獨(dú)應(yīng)用均能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。進(jìn)一步通過比較As2O3+at-RA組與As2O3組、at-RA組的細(xì)胞增殖和遷移能力可知，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠更為明顯的降低細(xì)胞的遷移和增殖能力。

目前，對(duì)于As2O3和at-RA酸抗腫瘤的機(jī)制尚未闡明，其潛在的分子作用靶點(diǎn)仍處于未知狀態(tài)[11]。探尋在黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移過程中的關(guān)鍵分子，有助于尋找更有效的生物治療靶點(diǎn)[12]。MMP-2是金屬蛋白酶家族的分子，能夠參與細(xì)胞外基質(zhì)的講解過程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍的浸潤(rùn)，其含量與腫瘤的浸潤(rùn)能力呈正相關(guān)[13-14]；Caspase-2則是執(zhí)行細(xì)胞凋亡功能的重要分子，通過下游PI3K、ERK、NF-Kb等信號(hào)通路來介導(dǎo)，其含量與腫瘤的增殖能力呈負(fù)相關(guān)[15-16]。本研究通過Western-blot的方法檢測(cè)不同處理組間MMP-2、Caspase-2的含量可知，As2O3和at-RA處理均能上調(diào)Caspase-2、下調(diào)MMP-2的表達(dá)，并且兩者具有協(xié)同作用，當(dāng)聯(lián)合給藥時(shí)，Caspase-2的表達(dá)得到了更為明顯的促進(jìn)，MMP-2的表達(dá)則得到了更為明顯的抑制。這就說明上調(diào)Caspase-2、下調(diào)MMP-2可能是As2O3和at-RA發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制，同時(shí)也為臨床尋找黑色素細(xì)胞瘤的治療提供了新的分子靶點(diǎn)。

綜上所述，As2O3和at-RA聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞株A375的增殖和遷移能力，這一作用可能是通過上調(diào)Caspase-2、下調(diào)MMP-2來發(fā)揮的。

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（收稿日期：2013-11-14 本文編輯：程 銘）