丁彥光，鄭如恒，肖祥之

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院，上海201700)

肝纖維化是各種慢性肝病共有的病理改變，是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，是在病毒性肝炎、慢性乙醇或藥物中毒、血吸蟲(chóng)肝病以及營(yíng)養(yǎng)缺乏等多種因素的作用下，引起肝細(xì)胞變性、壞死，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，刺激纖維組織增生而形成的。肝纖維化的病理特征是膠原的生成與降解失衡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多，降解相對(duì)不足，ECM的過(guò)度沉積。目前認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝臟中產(chǎn)生膠原等外基質(zhì)的主要細(xì)胞，而肝損傷—肝實(shí)質(zhì)炎癥—壞死-HSC激活—大量ECM沉積是肝纖維化發(fā)生機(jī)制的中心環(huán)節(jié)［1］。當(dāng)前眾多研究資料表明，如能早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療肝纖維化，病情可得到有效控制，肝纖維化尚有逆轉(zhuǎn)的可能，因此阻斷肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展成為治療慢性肝病的關(guān)鍵［2，3］。硫化氫(H2S)是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的又一嶄新課題，其具有擴(kuò)張血管、抑制血管平滑肌增殖和抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)效應(yīng)。目前關(guān)于這一新的氣體信號(hào)分子在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制尚不多見(jiàn)。2011年10月～2013年10月，我們觀察了外源性H2S對(duì)四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的抑制作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量為200～220 g，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑 硫氫化鈉(NaHS，美國(guó)Sigma公司);透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)及Ⅳ型膠原(CⅣ)放射免疫檢測(cè)試劑盒(上海海軍醫(yī)學(xué)研究所);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司);兔抗鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原單克隆抗體試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司)。

1.3 大鼠肝纖維化模型制備及處理 將50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組各10只，空白對(duì)照組皮下注射花生油2.0 mL/kg體質(zhì)量，肝纖維化組注射同劑量40%CCL4花生油，NaHS低劑量組注射同劑量40% CCL4花生油+NaHS 7μmol/kg，NaHS高劑量組注射同劑量40%CCL4花生油+NaHS 14μmol/kg，秋水仙堿組注射相同劑量40%CCL4花生油+秋水仙堿0.25 mg/kg灌胃，每周2次，共8周［4］。

1.4 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)第8周末處死大鼠，留取血液及肝組織標(biāo)本，取出肝臟后用冷的等滲鹽水灌注沖洗，選取部分肝臟組織，然后用10%中性甲醛固定，留做病理及免疫組化檢查，鏡檢觀察肝細(xì)胞變性與膠原纖維增生程度。

1.5 肝功能與脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)檢測(cè) 留取大鼠血液后分離血清，采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)ALT、AST。選取肝左葉同一部位組織，制備成肝勻漿，采用放射免疫法檢測(cè)肝臟組織HA、LN、PCⅢ、CⅣ;按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)肝組織SOD、MDA、 GSH-Px的酶活性。

1.6 肝臟病理學(xué)檢查 常規(guī)HE染色觀察肝組織學(xué)改變，網(wǎng)狀纖維和masson染色觀察肝纖維組織增生狀況。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野。根據(jù)肝組織病理變化，將大鼠肝纖維化的程度分為4期:0期為無(wú)纖維化;Ⅰ期為匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，局部竇周及小葉內(nèi)纖維化;Ⅱ期為匯管區(qū)周?chē)w維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留;Ⅲ期為纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)肝硬化;Ⅳ期為早期肝硬化，纖維結(jié)締組織在全小葉多處彌漫性增生，假小葉形成。

1.7 肝組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原檢測(cè) 采用免疫組化法。所有肝組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、4μm厚度連續(xù)切片。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、光鏡下觀察結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝功能與脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組肝功能與脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)比較(±s)

表1 各組肝功能與脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;與肝纖維化組比較，#P＜0.05

組別 ALT(U/L) AST(U/L) HA(U/L) LN(U/L) PCⅢ(U/L) CⅣ(U/L) SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)GSH-Px(U/mg)肝纖維化組 184.9±80.9* 259.1±37.4* 331.6±13.4* 69.4±11.5* 215.3±51.0* 48.6±15.4* 87.7±17.2* 12.3±2.2* 37.3±6.6* NaHS低劑量組 106.0±21.9# 187.8±48.2# 270.3±37.4# 52.7±9.1# 176.4±37.6# 41.3±17.1# 106.1±15.9# 10.4±3.5# 46.5±11.3# NaHS高劑量組 82.4±26.9# 107.5±35.0# 222.5±22.1# 48.5±6.4# 98.7±33.5# 25.8±9.7# 115.5±27.9# 7.3±1.7# 56.8±23.6#秋水仙堿組 58.5±21.2# 75.2±20.9# 162.0±24.5# 43.0±8.7# 67.7±23.8# 19.9±5.6# 148.1±32.0# 4.8±0.9# 75.9±19.0#空白對(duì)照組 44.6±9.2 79.4±17.6 117.4±16.0 38.3±8.1 58.0±13.2 10.1±3.2 187.2±32.1 3.6±1.4 91.1±13.4

2.2 各組肝臟病理形態(tài) 對(duì)照組大鼠肝組織的肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周排列整齊，中央靜脈及匯管區(qū)結(jié)締組織未見(jiàn)增生。肝纖維化組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞廣泛脂肪性變，匯管區(qū)炎性細(xì)胞、壞死細(xì)胞增多，纖維間隔向小葉內(nèi)伸展形成大小不一纖維包繞，細(xì)胞索排列紊亂，纖維間隔增厚，可見(jiàn)假小葉形成，可見(jiàn)明顯的大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。NaHS低劑量組、NaHS高劑量組及秋水仙堿組均明顯減輕肝纖維化程度，肝細(xì)胞脂肪變性程度減輕，雙核肝細(xì)胞較少，庫(kù)普弗細(xì)胞增生、肥大，匯管區(qū)膠原纖維較肝纖維化組顯著減少，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維的增生以及肝小葉的破壞和假小葉的形成等均有明顯的改善。

2.3 各組肝臟膠原增生程度比較 對(duì)照組大鼠肝組織肝小葉完整、肝索排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞無(wú)脂肪變性，在匯管區(qū)與中央靜脈周?chē)形⒘磕z原纖維分布。肝纖維化組肝細(xì)胞廣泛脂肪變性，肝索排列紊亂，匯管區(qū)炎性細(xì)胞、壞死細(xì)胞增多，匯管區(qū)和小葉內(nèi)出現(xiàn)局限性的纖維化，部分區(qū)域出現(xiàn)纖維分隔，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，甚至有假小葉形成。與肝纖維化組比較，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組肝組織膠原纖維異常分布明顯減少，變性壞死肝細(xì)胞減少，結(jié)締組織輕度增生。對(duì)照組肝纖維化分級(jí)均為0級(jí);肝纖維化組大多為3～4級(jí);NaHS低劑量組、NaHS高劑量組及秋水仙堿組大多為1～2級(jí)，與肝纖維化組比較纖維化程度明顯減輕(P均＜0.05)。

2.4 各組肝組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá) 空白對(duì)照組肝臟Ⅰ型膠原陽(yáng)性染色只見(jiàn)于匯管區(qū)和中央靜脈管壁，Ⅲ型膠原主要存在于大血管周?chē)?肝纖維化組肝臟Ⅰ型、Ⅲ型膠原廣泛存在于纖維間隔及肝細(xì)胞內(nèi)。與肝纖維化組比較，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組及秋水仙堿組大鼠肝臟中Ⅰ型、Ⅲ型膠原明顯減少，纖維間隔較薄。

3 討論

肝纖維化是多種類(lèi)型細(xì)胞、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等一系列復(fù)雜作用的結(jié)果，是以ECM成分的過(guò)度增生與異常沉積為主要特征。HSC是肝臟ECM的主要來(lái)源，是肝纖維化形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，肝損傷—肝實(shí)質(zhì)炎癥—壞死-HSC激活—大量ECM沉積，是肝纖維化發(fā)生機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。因此，阻斷肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)防治肝硬化和肝癌具有重要意義。氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化與肝纖維化形成的關(guān)系密切，氧化和抗氧化損傷的失衡可以促進(jìn)HSC的增殖，導(dǎo)致膠原合成增加。各種因素造成的肝損傷產(chǎn)生了大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物，超出了機(jī)體的清除能力，使其發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化、MDA水平提高、SOD含量減少。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物還可以損傷Kuppfer細(xì)胞、肝細(xì)胞，引起變性壞死，使氧自由基以及各種細(xì)胞因子大量釋放，致HSC被激活，大量ECM沉積，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。幾乎所有臨床和實(shí)驗(yàn)性肝纖維化都被證實(shí)與氧化應(yīng)激有關(guān)。

H2S是一種無(wú)色、易燃、能溶于水的，具有臭雞蛋氣味的氣體，數(shù)十年來(lái)，H2S只是作為一種污染環(huán)境的有毒氣體而被關(guān)注。20世紀(jì)90年代，Abe等［5］首次證明人體內(nèi)源性H2S可作為一種神經(jīng)活性物質(zhì)而存在，而越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，H2S不僅可以在人和動(dòng)物組織內(nèi)被代謝和生成，而且還廣泛參與機(jī)體多種生理和病理過(guò)程，H2S不僅可以調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、記憶及神經(jīng)元的興奮性，而且H2S還同NO和CO一樣，具有擴(kuò)張血管和消化道平滑肌、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和清除氧自由基的作用。內(nèi)源性H2S作為氣體小分子可以自由通過(guò)細(xì)胞膜，其作用不依賴(lài)于相應(yīng)的質(zhì)膜受體，而是在吡多醛-5'-磷酸依賴(lài)性酶包括胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶的作用下催化產(chǎn)生，并發(fā)生相應(yīng)的調(diào)控作用［6］。H2S其細(xì)胞學(xué)效應(yīng)可以依賴(lài)或不依賴(lài)第二信使cAMP的介導(dǎo)，具有特定的細(xì)胞和分子作用的靶點(diǎn)［7］。

近年來(lái)研究［8］證實(shí)，H2S在肝纖維化及門(mén)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要的保護(hù)性作用。有研究［9］發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者血漿H2S降低與肝功能有關(guān)，能明顯降低肝臟谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的水平。本研究顯示，肝纖維化組ALT、AST較空白對(duì)照組升高，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組ALT、AST較肝纖維化組降低，此與沈欽海等［10］研究一致。

研究［11］證明，氧應(yīng)激下H2S對(duì)HSC具有保護(hù)作用，可抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，提示H2S能夠參與氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD、GSH是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶，其反映了機(jī)體清除氧自由基的能力［12］。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要終產(chǎn)物，反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，它可促進(jìn)Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)，與HSC增殖和膠原合成密切。本研究顯示，肝纖維化組MDA較空白對(duì)照組升高，SOD、GSH-Px較空白對(duì)照組降低; NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組MDA較肝纖維化組降低，SOD、GSH-Px較肝纖維化組升高，此與王宏賓等［13］研究結(jié)果相同。

另外有研究發(fā)現(xiàn)，HA、LN、PCⅢ及CⅣ與肝纖維化形成關(guān)系密切相關(guān)［14］。本研究顯示，肝纖維化組HA、LN、PCⅢ、CⅣ較空白對(duì)照組升高，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組HA、LN、PCⅢ、CⅣ較肝纖維化組降低;且NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組肝纖維化程度較肝纖維化組減輕，肝組織膠原纖維異常分布較肝纖維化組減少。均提示外源性H2S能減少膠原的生成，抑制肝纖維化的進(jìn)程，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制HSC的激活，減少ECM的合成，從而發(fā)揮抗纖維化作用。

肝纖維化是以HSC的大量增殖，ECM過(guò)度沉積，膠原合成與表達(dá)增多，并在肝臟間質(zhì)內(nèi)聚集為重要表現(xiàn)，其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原是肝內(nèi)主要的間質(zhì)型膠原。本研究顯示，NaHS低劑量組、NaHS高劑量組、秋水仙堿組Ⅰ型、Ⅲ型膠原較肝纖維化組減少。其機(jī)制可能是NaHS在抑制肝臟HSC增殖的同時(shí)還抑制其膠原的合成與表達(dá)，此與劉文東等［15］研究結(jié)果一致。

總之，外源性H2S能有效抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與其清除自由基、提高抗氧化物酶的活性、抑制HSC的膠原合成、減少ECM在肝臟中的沉積有關(guān)。

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