陳 晨，胡文忠，何煜波，姜愛(ài)麗，薩仁高娃

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 生物化學(xué)工程國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧省食源性病原微生物快速檢測(cè)與控制工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116600)

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種常見(jiàn)的人畜共患病食源性革蘭氏陽(yáng)性致病菌[1]，在自然界中廣泛存在[2]，可以通過(guò)污染畜禽產(chǎn)品、蔬菜、水果等食物而引起人類感染致病[3-4]。近年來(lái)，由LM引起的食品中毒事件時(shí)有發(fā)生，且引起了人員死亡[5,6]。因此，對(duì)LM控制措施成為食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。乳酸鏈球菌素(nisin)是由某些乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)產(chǎn)生的安全且具有高效殺菌作用的多肽，目前許多國(guó)家允許其商業(yè)化生產(chǎn)作為食品防腐劑使用[7]，我國(guó)于1990 年由衛(wèi)生部食品監(jiān)督廳簽發(fā)了在國(guó)內(nèi)應(yīng)用 Nisin 作為食品保藏劑的使用合格證明書(shū)[8]。有機(jī)酸能降低環(huán)境 pH 值，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁運(yùn)輸系統(tǒng)和滲透壓，擾亂微生物的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而抑制微生物生長(zhǎng)繁殖，檸檬酸等有機(jī)酸常用于控制鮮切果蔬微生物的生長(zhǎng)和防止褐變[9-11]?，F(xiàn)階段研究利用nisin和檸檬酸來(lái)控制鮮切果蔬中LM的研究較多[12-15]，但同時(shí)對(duì)比研究nisin、檸檬酸以及二者復(fù)配對(duì)純培養(yǎng)LM及接種到鮮切黃瓜的LM的殺菌效果未有報(bào)道。本文比較研究了不同濃度的nisin、檸檬酸以及二者復(fù)配對(duì)純培養(yǎng)LM，以及人工接種到鮮切黃瓜上的LM處理不同時(shí)間后的殺菌效果，為探究鮮切果蔬的貯藏保鮮技術(shù)提供新的方法和思路。

1.材料方法

1.1 材料與儀器

黃瓜 購(gòu)于大連開(kāi)發(fā)區(qū)樂(lè)購(gòu)超市；菌株 LM標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19115）來(lái)自遼寧省疾病控制中心；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）、牛津瓊脂（OXA）基礎(chǔ)、牛津瓊脂（OXA）添加劑 青島海博生物技術(shù)有限公司；蛋白胨 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；乳酸鏈球菌素（nisin） 浙江銀象生物工程有限公司；檸檬酸：食品級(jí)、95%乙醇、無(wú)水乙醇等化學(xué)試劑為分析純。

MLS-3020 型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器日本 SANYO公司；1300系列 A2型二級(jí)生物安全柜 美國(guó)THERMO FISHER SCIENTIFIC公司；AB135-S型分析天平 瑞士 METTLER TOLEDO公司；BagM ixer-400W型均質(zhì)器 法國(guó)INTERSCIENCE公司；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HYC-326A型醫(yī)用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司；YLE-1000型電熱恒溫水浴鍋 北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原菌液的制備 在無(wú)菌室的生物安全柜內(nèi)無(wú)菌操作取標(biāo)準(zhǔn)LM菌株，在TSA-YE無(wú)菌平板上平行劃線活化，36℃培養(yǎng)24～48h后挑取單菌落接種到含有150m L無(wú)菌TSB-YE的三角瓶中，充分混勻，將三角瓶放入36℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48h至初始菌落數(shù)大致為107cfu/m L，即原菌液，4℃保存，備用。

1.2.2 接種菌液的制備 原菌液在4℃、5000rpm條件下離心5min后，棄去上清，沉淀用0.1%蛋白胨水沖洗，重復(fù)兩次，得到濃度約為107cfu/m L的菌懸液，即接種菌液，4℃保存，備用。

1.2.3 樣品制備 在無(wú)菌室內(nèi)，將新鮮黃瓜用自來(lái)水洗凈，用無(wú)菌刀將鮮切黃瓜切成約1cm×1cm×1cm的小塊，每20g一份置于一個(gè)無(wú)菌容器中。每份鮮切黃瓜樣品接種0.1 m L接種菌液，充分混勻，使樣品的初始菌數(shù)大致為104～105cfu/g。接種后，樣品在生物安全柜中干燥1h。

1.2.4 nisin和檸檬酸對(duì)純培養(yǎng)LM的處理 在無(wú)菌室的生物安全柜里以無(wú)菌操作將充分混勻的原菌液梯度稀釋約為105cfu/m L，即純培養(yǎng)原菌液。取0.5mL純培養(yǎng)原菌液分別加入含有4.5m L不同濃度 nisin（10、50、100μg/m L）和檸檬酸（0.1%、0.3%、0.5%）以及二者復(fù)配液(10μg/m L+0.1%、10μg/m L+0.3%、50μg/m L+0.1%、50μg/m L+0.3%)的試管中，充分混合振蕩不同時(shí)間（5、10、15、20 min）后，從中吸取 0.5m L加入到 4.5m l 無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，取 100μL 的稀釋液涂布于牛津瓊脂（OXA）平板上，36℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)[1]。每個(gè)處理做2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 nisin和檸檬酸對(duì)接種LM樣品的處理 在無(wú)菌室內(nèi)的生物安全柜里，分別把接種LM的鮮切黃瓜放入含100m L nisin和檸檬酸以及二者復(fù)配溶液的無(wú)菌燒杯中，攪拌浸泡不同時(shí)間（5min、10min、15min、20min），取出容器中的樣品置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入50mL滅菌的0.1%蛋白胨水，在拍擊式均質(zhì)機(jī)上連續(xù)均質(zhì) 1min，取上清菌懸液選擇合適稀釋度用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，取 100μL 的稀釋液涂布于牛津瓊脂（OXA）平板上，36℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。每個(gè)處理做2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS17.0進(jìn)行方差分析，用Origin8.0作圖.

2.結(jié)果與分析

2.1 Nisin對(duì)純培養(yǎng)和鮮切黃瓜LM殺菌效果的比較

圖1.不同濃度nisin對(duì)純培養(yǎng)（a）和鮮切黃瓜（b）LM的殺菌效果Fig.1 Disinfection effect of nisin for inactivation of LM in pure culture (a) and on fresh-cut cucumbers (b).

自來(lái)水以及不同濃度nisin對(duì)純培養(yǎng)和鮮切黃瓜處理不同時(shí)間后殘留LM的檢測(cè)結(jié)果如圖1a和圖1b所示，采用自來(lái)水清洗鮮切黃瓜后，鮮切黃瓜和純培養(yǎng)體系中的 LM 均有所降低，但降幅僅為 0.2～0.4 log cfu/g，說(shuō)明自來(lái)水的殺菌作用十分微弱，單純采用自來(lái)水清洗無(wú)法有效控制病原微生物的生長(zhǎng)，只有加入高效的殺菌劑才能夠保證鮮切果蔬的質(zhì)量安全[14]。當(dāng)清洗用水中加入nisin后，隨著nisin濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)其對(duì)LM的殺菌效果逐漸增強(qiáng)（p<0.05），并且對(duì)兩種介質(zhì)中LM的殺菌效果存在一定差異。當(dāng)nisin濃度小于50μg/m L時(shí)，純培養(yǎng)和鮮切黃瓜LM的減少量相當(dāng)，分別為0.1～1.1 log cfu/m L（純培養(yǎng)）和0.2～1.1 log cfu/g（鮮切黃瓜），當(dāng)nisin濃度增加到100μg/mL時(shí)，作用5min后使純培養(yǎng)體系中的LM降低到檢測(cè)限以下，而對(duì)鮮切黃瓜處理15min后才使LM低于檢測(cè)限。

2.2 檸檬酸對(duì)純培養(yǎng)和鮮切黃瓜LM殺菌效果的比較

圖2.不同濃度檸檬酸對(duì)純培養(yǎng)（a）和鮮切黃瓜（b）LM的殺菌效果Fig.2 Disinfection effect of citric acid for inactivation of LM in pure culture (a) and on fresh-cut cucumbers (b).

圖2a和圖2b分別表示不同濃度檸檬酸對(duì)純培養(yǎng)和鮮切黃瓜LM處理不同時(shí)間后的殺菌效果，如圖2所示，檸檬酸對(duì)LM的殺菌效果也是隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)（p<0.05）。當(dāng)檸檬酸濃度較低時(shí)對(duì)兩種體系中LM的殺菌作用無(wú)顯著差異（p>0.05），當(dāng)檸檬酸濃度增加到0.5%時(shí)，處理10min可以使純培養(yǎng)中的LM降低到檢測(cè)限以下，而此時(shí)對(duì)鮮切黃瓜LM的殺菌對(duì)數(shù)值僅為1.6 log (cfu/g)，但當(dāng)其處理15min后，則可使鮮切黃瓜的LM降低到檢測(cè)限以下。這一研究結(jié)果與2.1中 nisin對(duì)純培養(yǎng)和鮮切黃瓜LM殺菌效果一致。分析原因可能是采用nisin或檸檬酸清洗接種后的鮮切黃瓜時(shí)攪動(dòng)不夠充分，LM無(wú)法與殺菌劑充分接觸[16]；也可能是接種到鮮切黃瓜表面的LM進(jìn)入到了黃瓜組織內(nèi)部[17]，清洗時(shí)殺菌劑需要足夠的時(shí)間進(jìn)入黃瓜組織內(nèi)部殺死LM。

2.3 Nisin和檸檬酸復(fù)配對(duì)純培養(yǎng)和鮮切黃瓜LM殺菌效果的比較

Nisin和檸檬酸復(fù)配對(duì)純培養(yǎng)和鮮切黃瓜LM殺菌效果如圖3所示，總體來(lái)看，nisin和檸檬酸復(fù)配的殺菌效果要優(yōu)于二者單獨(dú)使用（p<0.05）。當(dāng)nisin和檸檬酸復(fù)配濃度為 10μg/m L+0.1%，50μg/m L+0.1%以及10μg/m L+0.3%時(shí)，對(duì)純培養(yǎng)體系中LM的殺菌效果高于對(duì)鮮切黃瓜中LM的殺菌效果。當(dāng)二者復(fù)配濃度增加到50μg/m L+0.3%時(shí)，處理20min后可以使純培養(yǎng)體系中的LM達(dá)到檢測(cè)限以下；而鮮切黃瓜中的LM僅需15min就可以降低到檢測(cè)限以下。由此可見(jiàn)，nisin和檸檬酸的復(fù)配使二者間產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)了對(duì)LM 的殺菌效果。Xu等人研究表明單獨(dú)使用 nisin沒(méi)有使鮮切黃瓜和鮮切萵苣中 LM 的數(shù)量顯著降低（p>0.05），當(dāng)nisin與檸檬酸和葡萄籽提取物聯(lián)合使用后，可顯著降低LM的數(shù)量（p<0.05）[15]。石玉新等人研究表明nisin和檸檬酸聯(lián)合使用對(duì)嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌的抑菌效果要明顯優(yōu)于檸檬酸單獨(dú)使用[18]。相對(duì)于對(duì)純培養(yǎng)體系中LM 的殺菌效果，濃度越高的檸檬酸和nisin的復(fù)配對(duì)鮮切黃瓜中的LM作用效果越強(qiáng)，這可能是由于高濃度的檸檬酸有助于增強(qiáng)nisin在鮮切黃瓜組織中的通透性，提高了nisin與LM的有效作用時(shí)間。

圖3.Nisin和檸檬酸復(fù)配對(duì)純培養(yǎng)（a）和鮮切黃瓜（b）的殺菌效果Fig.3 Disinfection effect of nisin combination w ith citric acid for inactivation of LM in pure culture (a) and on fresh-cut cucumbers (b)

3.結(jié)論

不同濃度的 nisin和檸檬酸及二者復(fù)配對(duì)純培養(yǎng)以及接種到鮮切黃瓜上的單增李斯特菌均具有一定的殺菌作用，殺菌效果隨著濃度的增加以及作用的時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，且nisin和檸檬酸復(fù)配殺菌效果要優(yōu)于二者的單獨(dú)使用。100μg/m L nisin和0.5%檸檬酸單獨(dú)使用可使純培養(yǎng)和鮮切黃瓜中的單增李斯特菌降低到檢測(cè)限以下，當(dāng)二者聯(lián)合使用時(shí)，50μg/m L nisin+0.3%檸檬酸即可使兩種介質(zhì)中的單增李斯特菌降低至檢測(cè)限以下。

通過(guò)比較nisin和檸檬酸及二者復(fù)配對(duì)兩種介質(zhì)中單增李斯特菌的殺菌效果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)nisin和檸檬酸濃度較低時(shí)，純培養(yǎng)及鮮切黃瓜中單增李斯特菌的減少量無(wú)明顯差異，當(dāng)濃度較高時(shí)，5-10min內(nèi)即可將純培養(yǎng)體系中的單增李斯特菌降低到檢測(cè)限以下，而對(duì)于鮮切黃瓜則需要15min；當(dāng)nisin和檸檬酸二者復(fù)配濃度為50μg/m L+0.3%時(shí)，使鮮切黃瓜中單增李斯特菌降低到檢測(cè)限以下需要15min，殺菌時(shí)間略短于純培養(yǎng)體系（20min），在試驗(yàn)選用的其余三組復(fù)配濃度條件下，純培養(yǎng)體系中單增李斯特菌的減少量要高于鮮切黃瓜中單增李斯特菌的減少量。

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