劉 萍，高云濤*，張麗珠，張宏教，虞姣姣，茶家偉

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500；2.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室，云南昆明 650500）

人體的許多疾病與衰老都與自由基氧化損傷有關(guān)[1]，從天然物質(zhì)中尋找高效低毒的抗氧化活性物質(zhì)受到廣泛的關(guān)注，自由基的發(fā)生與檢測是抗氧化活性評估的關(guān)鍵，目前用于評估天然抗物抗氧化活性的自由基的發(fā)生體系包括羥自由基Feton體系、超氧自由基鄰苯三酚自氧化體系、超氧自由基電化學(xué)發(fā)生體系和人工合成的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基等[2-3]，檢測方法有分光光度法、電化學(xué)檢測法、高效液相色譜質(zhì)譜法（HPLC）、氣質(zhì)聯(lián)用法、化學(xué)發(fā)光法（CL）和電子順磁共振（EPR，或ESR）[4-9]等，DPPH自由基是種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，其反應(yīng)變色敏銳，且濃度與吸光度線性關(guān)系好，適合分光光度檢測，具有操作快速、準(zhǔn)確且穩(wěn)定可靠等特點，廣泛應(yīng)用于評價天然物質(zhì)抗氧化活性中[10-14]。但常規(guī)分光光度檢測樣品消耗量大，方法的準(zhǔn)確性尚未有文獻系統(tǒng)的研究，不適合天然產(chǎn)物研究中的微量成分研究。在天然產(chǎn)物分離中，很多時候所獲得活性成分通常少于1mg，因此，發(fā)展活性成分抗氧化活性微量化檢測方法具有重要價值。酶標(biāo)儀-微孔板方法目前報道的主要微量化方法，王麗等[15-16]研究了蘆丁清除DPPH·的酶標(biāo)儀-微孔板微量篩選模型，能快速、準(zhǔn)確地對微量天然產(chǎn)物單體化合物的抗氧化性進行篩選。本實驗室李曉芬等[17]提出一種植物多酚清除 DPPH自由活性的微量電化學(xué)滴定方法，提出了以植物多酚與 DPPH自由反應(yīng)的化學(xué)計量關(guān)系評價其抗氧化活性的新思路。但目前抗氧化活性的微量化檢測方法仍然有限，且上述方法需要專門的儀器，不易普及。

本文基于光度滴定方法原理，以山奈酚[18]為研究對象，提出一種新型活性成分清除DPPH·的微量光度滴定法，方法結(jié)合了分光光度法靈敏度高及滴定分析準(zhǔn)確好的優(yōu)點，以微量進樣器在DPPH溶液中滴加活性成分，記錄滴定過程中DPPH·的吸光度變化，確定活性成分與DPPH·反應(yīng)的化學(xué)計量關(guān)系，以此評價活性成分清除DPPH·的能力，并通過與常規(guī)DPPH·清除檢測方法進行了對照方法驗證。研究表明，本文提出的 DPPH·清除活性的微量光度滴定法樣品使用量明顯下降，具有準(zhǔn)確性好、簡單、易于普及、成本低等特點，應(yīng)用前景較好，為抗氧化活性的微量化檢測提出了一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8453型UV-Vis分光光度計 美國安捷倫公司；7200 型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；10mm和30mm比色皿 宜興市曄輝玻璃儀器廠；AS3120A超聲清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；AL204電子天平 鄭州南北儀器有限公司；10μ微量進樣器 上海高鴿（±0.1μL）。

DPPH（1,1-di-phenyl-2-picryhydrazyl，純度＞99%） 購于美國 Sigma公司，以乙醇溶解，配制為2.54×10-4mol·L-1（0.1mg·m L-1），于4℃儲存，48 h內(nèi)使用，使用時用乙醇稀釋為所需濃度；山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品 購于國藥集團浙江華東醫(yī)藥有限公司，純度＞98%，使用時以乙醇溶解，配制為3.49×10-4mol·L-1（0.1mg·m L-1），于4℃儲存；無水乙醇 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 微量光度滴定法

微量光度滴定法使用可見分光光度計，30cm比色皿以獲得較大測定體積，減少相對誤差。配制不同濃度的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，于30mm的比色皿中，測定DPPH溶液在517nm處的吸光度值，計算濃度與吸光度關(guān)系回歸方程。經(jīng)測定，本文吸光度與DPPH溶液濃度的關(guān)系回歸方程為：A=0.0892cD+0.0056（r=0.9994），式中，A為吸光度，cD為DPPH溶液濃度。

另取一定濃度的DPPH溶液至30mm的石英比色皿中，用微量進樣器以每次10μL逐漸滴加一定濃度山奈酚溶液，混勻，蓋上比色皿蓋，待反應(yīng)3min后，記錄滴加山奈酚后DPPH溶液在517nm處的吸光度值，繪制山奈酚加入量與DPPH溶液吸光度變化的測定曲線，根據(jù)吸光度與DPPH溶液濃度的關(guān)系計算溶液中剩余DPPH溶液濃度（c1），結(jié)合根據(jù)DPPH溶液初始濃度（c0）計算與山奈酚反應(yīng)的DPPH·物質(zhì)的量：nD（mol）=（c0- c1）V，V為溶液體積（m L），繪制山奈酚累積加入量nK（mol）與所消耗DPPH·物質(zhì)量nD的關(guān)系曲線。

考慮DPPH溶液的不穩(wěn)定性，實驗應(yīng)該盡量在避光條件密閉條件下進行。

1.2.2 DPPH·清除試驗

用于對照試驗的DPPH·清除試驗采用常規(guī)方法，見文獻[19-20]。在避光條件下，取一定濃度DPPH溶液至10m L比色管中，分別加入不同濃度的山奈酚溶液，混勻，加比色皿塞，待反應(yīng)20min后，測定其在517nm處吸光度（Aj），測定試劑空白溶液吸光度（A0）以及相應(yīng)山奈酚溶液吸光度（Ai），計算DPPH自由基清除率（E）。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收曲線及反應(yīng)時間

DPPH·的光度分析通常以DPPH溶液在517nm處的褪色反應(yīng)為基礎(chǔ)，若所測定的活性物質(zhì)在517nm附近也存在吸收，則可能對DPPH·光度測定帶來干擾，所以需考查所研究樣品對DPPH·光譜吸收的影響。DPPH·和山奈酚溶液UV-Vis光譜測定結(jié)果見圖1，DPPH·在328、517nm處有兩個強吸收峰，與文獻[19]一致。而山奈酚溶液則在267、368nm處有兩個吸收帶，山奈酚的的光譜吸收對DPPH·在517nm處的吸收無干擾。圖1表明，DPPH溶液中與不同濃度的山奈酚反應(yīng)后，DPPH在517nm處的吸收逐漸降低，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。因此，通過測定DPPH溶液在517nm處的褪色反應(yīng)，可準(zhǔn)確反應(yīng)山奈酚對DPPH·的清除作用。

圖1 DPPH、山奈酚的吸收曲線以及DPPH與不同濃度山奈酚反應(yīng)的吸收光譜曲線Fig.1 UV-Vis absorption spectrogram of DPPH and kaempferol，and DPPH w ith different concentrations of kaempferol

滴定分析是基于滴定劑與被滴定物質(zhì)反應(yīng)達平衡時的計量關(guān)系為基礎(chǔ)，而不同的活性物質(zhì)與DPPH·反應(yīng)達到平衡的時間可能存在著差異性，反應(yīng)到達平衡后進行測定才能保證測定的準(zhǔn)確性。鑒于此，本文首先考查了DPPH溶液在測定條件下的穩(wěn)定性，研究表明：室溫下（21℃）DPPH溶液在1 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，但在見光和敞開的條件下，放置時間超過1h，新鮮配制的DPPH溶液紫紅色將變淺，吸光值下降，放置5h和10h后，DPPH溶液吸光度僅分別約為初始值的4/5和3/5。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，實驗應(yīng)在避光且使用帶蓋比色皿，在避光及帶蓋比色皿條件下，2h內(nèi)，新鮮配制的DPPH溶液吸光值基本保持不變，所以實驗應(yīng)該低溫避光，上蓋且盡快完成。

由于不同濃度的活性物質(zhì)與DPPH的反應(yīng)有可能存在差異，本文以0.005mg·m L-1DPPH溶液與兩種濃度水平的山奈酚（高濃度為 0.0035mg·m L-1，低濃度為 0.0005mg·m L-1）進行反應(yīng)，研究反應(yīng)時間對山奈酚與DPPH·反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖2。在0.005mg·m L-1DPPH溶液中加入高低濃度的山奈酚，吸光度迅速減小，但達到反應(yīng)平衡的時間不同。加入0.0005mg·m L-1山奈酚，10min后吸光度到達穩(wěn)定，而加入 0.0035mg·m L-1山奈酚后迅速下降，3min后吸光度幾乎不變，說明 0.005mg·m L-1DPPH與0.0005mg·m L-1和0.0035mg·m L-1山奈酚反應(yīng)達平衡時間分別為10min和3min，即濃度增加，山奈酚與DPPH·反應(yīng)達到平衡時間將延長。本文的研究中，為保證在山奈酚與DPPH·反應(yīng)達到平衡時進行測定，微量光度滴定法因每次加入的山奈酚量很小，所以選擇在加入后3min進行測定，而在對照試驗中，因加入山奈酚量相對較大，選擇在加入后20 min進行測定。

圖2 反應(yīng)時間對山奈酚與DPPH反應(yīng)的影響Fig.2 The effect of reaction time on the absorbance of DPPH reacting w ith kaempferol

2.2 微量光度滴定曲線及化學(xué)計量關(guān)系

根據(jù) 1.2.1方法，本文選擇了高（22.82×10-8mol/10m L）、中（15.22×10-8mol/10m L）和低（7.60×10-8mol/10m L）3個初始濃度的DPPH溶液，測定山奈酚對3種濃度的DPPH·的滴定曲線（DPPH濃度的選擇原則是盡量使其吸光度值在0.3～0.8之間，以保證測定的精度）。結(jié)果見圖3。從圖中可知，與山奈酚反應(yīng)后，DPPH·在 517nm的吸光值呈線性下降，但山奈酚加入量達到一定濃度時，滴定曲線出現(xiàn)1個拐點，DPPH·吸光度趨于穩(wěn)定，表明山奈酚清除DPPH已達最大，滴定曲線的拐點可視為滴定終點，對滴定曲線拐點前的線性部分作回歸分析，對于高、中、低三個濃度的 DPPH·，線性回歸方程分別為 A=-0.0247x +0.8377（R2=0.9994）、A=-0.0235x +0.5464（R2=0.9995）和 A=-0.0226x +0.2977（R2=0.9992）。式中，A為DPPH·在517 nm處吸光度，x為山奈酚濃度，R2為相關(guān)系數(shù)，三個的相關(guān)系數(shù)R2值可看出，滴定曲線線性關(guān)系良好，精密度較高。

圖3 微量光度滴定曲線Fig.3 The curve of micro-photometric titration

依照1.2.1方法，分別計算出不同DPPH·初始量山奈酚加入量nK及所消耗的DPPH·物質(zhì)量nD的關(guān)系，結(jié)果見圖4。nK與nD的關(guān)系曲線，該曲線的線性部份反映了滴定過程山奈酚與DPPH·的化學(xué)計量關(guān)系，滴定終點時（拐點）對應(yīng)的DPPH·消耗量（nDmax）則反映了山奈酚能清除的最大DPPH·量，通過nDmax可以計算山奈酚對DPPH最大清除率ECmax，ECmax=nDmax/n0，式中，n0為DPPH初始量。從圖4可知，到達滴定終點前，盡管DPPH初始量不同，nK與nD曲線均具有良好的線性關(guān)系，且三條曲線幾乎重疊，說明反應(yīng)過程中山奈酚均遵循幾乎相同的化學(xué)計量關(guān)系與DPPH進行反應(yīng)。本文以DPPH消耗量nD與山奈酚加入量nK化學(xué)計量數(shù)比（nD/nK）[21]表示這種化學(xué)計量關(guān)系，表1是不同DPPH初始量滴定過程中的nD/nK和ECmax計算結(jié)果。從表1可知，在滴定過程中，隨著山奈酚逐漸加入，nD/nK幾乎不變，且不同DPPH起始量的nD/nK并無顯著差異，當(dāng)DPPH初始量(×10-8mol)為7.60、15.22和22.82時，山奈酚對DPPH最大清除率ECmax（nDmax/n0，100%無明顯差異，分別為：82.89%，84.88%和84.22%，說明滴定過程中nD/nK和nDmax/n0不因DPPH濃度不同而變化。表1可看出，測定精密度依DPPH初始量增加而增加，不同DPPH初始量(×10-8mol)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD %）順序是：22.82（2.75）<15.22（3.29）<7.60（5.66），說明過低的DPPH起始量不利于測定的精密度與準(zhǔn)確性。

圖4 山奈酚加入量（nK）及所消耗DPPH量（nD）的關(guān)系Fig.4 The relationship of Kaempferol dosage (nK) and the amount consumed of DPPH (nD)

山奈酚與DPPH的化學(xué)計量關(guān)系反映了山奈酚清除DPPH的能力，常規(guī)自由基清除試驗以清除率達50%時抗氧化劑濃度（EC50%）表達其清除自由基的能力，但EC50%隨自由基的初始量而明顯不同，目前文獻所報道的DPPH清除試驗中，DPPH初始量不盡相同，因此，所獲得的EC50%值不具有可比性。而本文提出的微量光度滴定法以滴定過程中抗氧化劑與DPPH的化學(xué)計量數(shù)比不隨DPPH初始量相同而變化，因此，化學(xué)計量數(shù)比表達其清除自由基的能力更加合理，可比性好，且本文的方法所獲得的化學(xué)計量數(shù)比精密度好，結(jié)果更可靠。

表1 微量滴定過程化學(xué)計量數(shù)比（nD/nK）、最大清除率（ECmax）和半數(shù)清除率（EC50%）測定結(jié)果Table.1 The results of stoichiometric ratio (nD / nK), the maximum scavenging rate (ECmax) and half of the scavenging rate (EC50%) of micro-photometric titration

15.22 1.78 1.77 1.72 1.72 1.79 1.72 1.74 1.79 1.88 1.82 1.89 1.88 1.87 1.80 1.77 1.72 1.78 3.29 84.88 0.0428 22.82 1.63 1.66 1.66 1.69 1.70 1.77 1.76 1.76 1.78 1.80 1.77 1.81 1.81 1.80 1.78 1.79 1.79 1.74 1.74 1.76 1.73 1.78 1.79 1.80 1.80 1.82 1.81 1.82 1.80 1.76 1.75 1.73 1.76 2.75 84.22 0.0648

2.3 對照試驗

對微量光度滴定法與常規(guī)DPPH清除分光光度法進行對照試驗，目前文獻報告的常規(guī)方法DPPH的濃度不盡相同，選擇的依據(jù)是保證測量條件下具有一定初始吸光度（A0,通常在0.5～0.7之間），以保證測定的準(zhǔn)確性。在本文的研究中，常規(guī)方法與微量光度滴定法選擇的比色皿分別為1.0cm和3.0cm，因此，常規(guī)方法和微量光度滴定法DPPH初始量分別為7.1×10-4mmol（濃度為0.142mmol/L，A0為0.74）和2.1×10-7mol（濃度為0.042mmol/L， A0為0.68）。對照試驗的結(jié)果見表2。從表2可知，盡管計算方法不同，但本法與常規(guī)方法的最大清除率ECmax和半數(shù)清除濃度EC50%（相當(dāng)于常規(guī)方法DPPH初始量）結(jié)果相近，而本文的ECmax和EC50%測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）更低，說明本法具有正好的精密度，按照表2 DPPH初始量，對本法進行連續(xù)5d測定，測得nD/nK和EC50%的RSD值為4.17%。從山萘酚消耗量看，常規(guī)方法需使用DPPH樣品系列以測定不同劑量山萘酚的清除作用，而本法通過在同一個DPPH樣品中滴加微量山萘酚，完成一組測定時山萘酚及 DPPH消耗大大減少。以蘆丁作為對照，在相同條件下用本法測定了蘆丁的nD/nK、ECmax（%）和EC50%，從結(jié)果看山奈酚的nD/nK略高于蘆丁，EC50%略低于蘆丁，表明山奈酚抗氧化活性略高于蘆丁，抗氧化活性較好。

表2 常規(guī)方法與本法試驗結(jié)果對照Table2 The results of general and this new method comparison

3 結(jié)論

本文提出一種新型活性成分DPPH自由基清除活性的微量光度滴定法，通過山奈酚清除DPPH自由基的紫外-可見吸收光譜學(xué)特征研究，確定了山奈酚對DPPH自由基在517nm處的吸收無光譜干擾，研究了常規(guī)方法和本法的山奈酚與DPPH的反應(yīng)時間分別為20min和3min，其反應(yīng)達到平衡，確定了山奈酚與DPPH反應(yīng)的化學(xué)計量關(guān)系為1:1.78，以此評價活性成分清除DPPH自由基的能力。通過與常規(guī)DPPH清除檢測方法進行對照對方法進行了驗證，結(jié)果表明本文提出的DPPH自由基清除活性的微量光度滴定法樣品使用量明顯下降且更精確，具有準(zhǔn)確性好、簡單、易于普及、成本低等特點，應(yīng)用前景較好，為抗氧化活性的微量化檢測提出了一種新的思路。

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