史娟

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，多糖所具有的增強(qiáng)免疫功能，抗輻射、抗腫瘤、抗炎、降血糖等生物活性，逐漸被人們發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，成為當(dāng)前新藥發(fā)展的方向之一。山茱萸（Fructus corni）作為山茱萸科植物山茱萸的干燥果實(shí)，因其抗氧化作用[1]、抗癌、抗腫瘤作用[2-3]、抗衰老作用[4]及保護(hù)腦組織等作用[5]而成為生物醫(yī)藥研究、開(kāi)發(fā)的一大熱點(diǎn)。目前，山茱萸多糖的提取技術(shù)主要包括熱水提取法[6]、堿提取法[7]、超聲波提取法[8]、微波提取法[9]和酶提取法[10]。其中，超聲波、微波提取法因其速度快、能耗小、溶劑用量小等特點(diǎn)受到青睞。目前，關(guān)于微波、超聲波技術(shù)聯(lián)合用于山茱萸多糖的提取及穩(wěn)定性的研究報(bào)道尚未見(jiàn)到。本文將微波、超聲波技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于山茱萸多糖的提取，并對(duì)提取多糖進(jìn)行穩(wěn)定性研究。以期獲得山茱萸多糖的最佳提取條件及穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及深加工提供有效方法及技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料與試劑

山茱萸2011年10月下旬收于漢中佛坪縣，洗凈、烘干、粉碎后，經(jīng)乙醚、乙醇回流脫脂脫色后密封備用。

1.1.2 試劑

葡萄糖、乙醚、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、濃硫酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鋁、氯化鈣、氯化銅、氯化鐵、檸檬酸、苯甲酸鈉、30%H2O2、亞硫酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。水為二次去離子水。

1.1.3 儀器

101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；FW117 粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；AL204-IC 型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；WP700 型微波爐：佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司；SB-5200DT 超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；HH 系列恒溫水浴鍋：河北省黃驊市渤海電器廠；TDL-5 臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；721 型可見(jiàn)分光光度計(jì)：山海光譜儀器有限公司制造；RE-52B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；PHS-3S 型pH 酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山茱萸多糖提取方法

山茱萸果實(shí)→烘干→粉碎→乙醚、乙醇回流脫脂脫色→微波預(yù)處理→超聲波提取→蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀過(guò)夜→Savage 法除蛋白→二次醇沉→靜置過(guò)夜→無(wú)水乙醇洗滌→低溫干燥→山茱萸多糖。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0、24.0、28.0 mL 于100 mL 容量瓶中，蒸餾水定容；再分別吸取上述各溶液1.0 mL 于25 mL比色管中，加入1.0 mL 2%苯酚和5.0 mL 濃硫酸；搖勻，沸水浴加熱15 min 后，冰水浴中冷至室溫，以蒸餾水為空白，在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of polysaccharide

1.2.3 山茱萸中多糖含量的測(cè)定方法

苯酚-硫酸比色法測(cè)定山茱萸多糖含量[11]，多糖提取率計(jì)算采用：多糖提取率＝（C×V）/W×100%，式中C 為按標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的多糖溶液濃度；V 為多糖溶液體積；W 為原料質(zhì)量。

1.2.4 提取實(shí)驗(yàn)

采用不同超聲時(shí)間、溫度、料液比及醇沉濃度4個(gè)因素對(duì)山茱萸多糖提取率的影響進(jìn)行單因素考查。并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1），尋求最佳提取工藝條件。

表1 四因素三水平正交試驗(yàn)表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.5 山茱萸多糖的穩(wěn)定性試驗(yàn)

取山茱萸多糖溶液，通過(guò)改變酸堿度、加入不同金屬離子、食品添加劑、氧化還原劑等的水溶液，在一定條件下放置一段時(shí)間，在波長(zhǎng)為490 nm 處測(cè)定不同溶液的吸光度，考察山茱萸多糖在上述條件下的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳單因素的確定

2.1.1 超聲提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g 脫脂脫色后的山茱萸粉末，微波預(yù)處理60 s，在料液比1 ∶14（g ∶mL）、提取溫度60 ℃的條件下，改變超聲處理時(shí)間，研究多糖提取率。超聲提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響如圖2 所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of time on polysaccharide yield

結(jié)果表明，隨著超聲提取時(shí)間的增加，山茱萸多糖得率逐漸提高。在80 min 時(shí)，多糖得率達(dá)到最高。此后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率開(kāi)始下降。故最佳超聲提取時(shí)間為80 min。

2.1.2 超聲提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g 脫脂脫色后的山茱萸粉末，微波預(yù)處理60 s 后，在料液比1 ∶14（g ∶mL）、超聲提取時(shí)間80 min 的條件下，改變超聲處理溫度，研究多糖提取率。溫度對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖3，隨著提取溫度升高，多糖得率隨之增加，在60 ℃多糖得率最高。

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on polysaccharide yield

2.1.3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g 脫脂脫色后的山茱萸粉末，微波預(yù)處理60 s 后，在超聲處理時(shí)間80 min，溫度60 ℃的條件下，研究料液比對(duì)山茱萸多糖提取效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on polysaccharide yield

圖4 反映出了料液比對(duì)多糖提取率的影響，料液比低于1∶14（g/mL）時(shí)，增大料液比，多糖提取率隨之增加；料液比大于1∶14（g/mL）后，提取率減小。這是因?yàn)槿軇┯昧可伲霞?xì)胞組織浸潤(rùn)不完全，提取效果差；而過(guò)多溶劑則會(huì)消耗大量超聲波輻射能量，因而影響多糖的析出。因此，選擇料液比1∶14（g/mL）為宜。

2.1.4 醇沉濃度對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g 脫脂脫色后的山茱萸粉末，微波預(yù)處理60 s 后，在超聲處理時(shí)間80 min，提取溫度60 ℃，料液比為1∶14（g/mL）條件下，改變醇沉濃度，研究多糖提取率。醇沉濃度對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，隨著乙醇濃度升高，多糖得率隨之增加，在乙醇濃度75%時(shí)，多糖得率最高。

圖5 醇沉濃度對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effect of alcohol concentration on polysaccharide yield

2.2 正交試驗(yàn)得出各因素交互作用對(duì)山茱萸多糖提取含量的影響

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

正交試驗(yàn)分析由表2 可知，在山茱萸多糖超聲提取的因素中：時(shí)間A＞溫度B＞醇沉濃度D＞料液比C，優(yōu)方案為A2B2C2D1，故最佳提取條件為：提取時(shí)間80 min，提取溫度60 ℃，料液比1 ∶14（g/mL），乙醇濃度為65 %。方差分析各因素與極差分析結(jié)果是一致，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法合理，操作符合規(guī)范。

2.2.2 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步確定山茱萸多糖微波預(yù)處理-超聲波提取的最佳工藝條件，在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇最優(yōu)水平組合：A2B2C2D1，并在此條件下提取山茱萸多糖，平行3 次，多糖提取率平均值為16.83%。

2.3 山茱萸多糖的穩(wěn)定性研究

2.3.1 金屬離子對(duì)山茱萸多糖的影響

取4 mL 的多糖溶液6 份，分別加入0.05 mol/L 的KCl、NaCl、CaCl2、AlCl3、FeCl3、CuCl2溶液2 mL，搖勻避光靜置2h，用苯酚-硫酸比色法測(cè)其吸光度結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 金屬離子對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響Fig.6 Influence of metal ions on polysaccharide stability

由圖6 可以看出，幾種金屬離子對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響。K+、Ca2+、Na+離子使多糖吸光度明顯下降，F(xiàn)e3+、Cu2+使吸光度大幅上升，僅有Al3+對(duì)吸光度影響不大。說(shuō)明山茱萸多糖在此條件下可能與K+、Ca2+、Na+、Fe3+、Cu2+發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。

2.3.2 pH 對(duì)山茱萸多糖的影響

取4mL 的多糖溶液6 份，用0.1mol/LHCl和0.1mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，避光處理2 h，用苯酚-硫酸比色法測(cè)其吸光度。由圖7 可知pH 對(duì)山茱萸多糖穩(wěn)定性的影響，在酸性條件下，多糖的吸光度變化較??；而堿性條件下，多糖的吸光度隨著pH 先增后減。由此表明，山茱萸多糖在酸性介質(zhì)中比較穩(wěn)定，在堿性介質(zhì)穩(wěn)定性較差。

圖7 pH 對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響Fig.7 Influence of pH value on polysaccharide stability

2.3.3 食品添加劑對(duì)山茱萸多糖的影響

取4 mL 的多糖溶液3 份，分別加入0.05 mol/L 的VC、檸檬酸、苯甲酸鈉2.0 mL，保溫2 h，用苯酚-硫酸比色法測(cè)其吸光度。食品添加劑對(duì)山茱萸多糖穩(wěn)定性的影響見(jiàn)表4。

表4 食品添加劑對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響Table 4 Influence of food additives on polysaccharide stability

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯甲酸鈉的加入對(duì)多糖的影響不大，檸檬酸、VC的加入導(dǎo)致吸光度明顯增加，說(shuō)明這兩種物質(zhì)對(duì)山茱萸多糖的影響較大。

2.3.4 氧化還原劑對(duì)西洋參葉多糖的影響

取4 mL 的多糖溶液10 份，分別加入濃度為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L 的H2O2和Na2SO3溶液 各2.0 mL，振蕩避光保存2 h，用苯酚-硫酸比色法測(cè)定吸光度。氧化還原劑對(duì)山茱萸多糖穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖8。

圖8 氧化還原劑對(duì)多糖穩(wěn)定性的影響Fig.8 Influence of oxidant and reductant on polysaccharide stability

由圖8 可知，多糖吸光度值隨著氧化還原劑濃度的增大，逐漸降低，說(shuō)明山茱萸多糖在氧化還原劑中的穩(wěn)定性較差。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用微波預(yù)處理-超聲波法從山茱萸中提取多糖，其最優(yōu)化工藝條件：超聲時(shí)間80 min、溫度60 ℃、料液比1∶14（g/mL），乙醇濃度65%，此工藝下得到的山茱萸多糖提取率為16.83%。與常見(jiàn)的熱水提取法[6]、微波提取法和酶提取法[10-11]相比，該法產(chǎn)率高、方法簡(jiǎn)便、節(jié)能環(huán)保。山茱萸多糖在Al3+、苯甲酸鈉及弱酸性溶液中穩(wěn)定性較好；而在K+、Ca2+、Na+、Fe3+、Cu2+、檸檬酸鈉、VC、氧化還原劑中穩(wěn)定性較差。因此在綜合開(kāi)發(fā)利用山茱萸多糖產(chǎn)品時(shí)應(yīng)注意避免與影響其穩(wěn)定性的物質(zhì)直接接觸。

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