王曉虹，王蘇平，車菊華，王 虹，汪 濤，朱艷玲

·基礎(chǔ)研究·

大鼠視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法的改良

王曉虹，王蘇平，車菊華，王 虹，汪 濤，朱艷玲

目的改良既往新生大鼠視神經(jīng)組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞。方法新生2 d SD大鼠，無菌條件下取雙側(cè)視神經(jīng)，置于預(yù)先涂有多聚賴胺酸的培養(yǎng)皿中(直徑3.5 cm)，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液約400 μL；培養(yǎng)第4天時，更換為含0.5%胎牛血清化學(xué)限定培養(yǎng)液約400μL；約第10天時，更換為無胎牛血清化學(xué)限定培養(yǎng)液約600μL；第11天行髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定，計算陽性細(xì)胞百分率。重復(fù)培養(yǎng)3次，方差分析方法的穩(wěn)定性。結(jié)果視神經(jīng)培養(yǎng)至第11天，每皿細(xì)胞數(shù)可達(6～8)×105個，90%以上為MBP陽性細(xì)胞；3次培養(yǎng)細(xì)胞的MBP免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論本實驗方法所得成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞純度高，數(shù)量足夠一般細(xì)胞生物學(xué)實驗使用，且方法簡便、穩(wěn)定。

視神經(jīng)；少突膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)

少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，其突起包繞神經(jīng)元軸突構(gòu)成多層膜性結(jié)構(gòu)，協(xié)助神經(jīng)電信號的跳躍式高效傳遞，維持和保護神經(jīng)元的正常功能。開展少突膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)，有利于研究少突膠質(zhì)細(xì)胞形成髓鞘的機制、損傷后修復(fù)，為臨床治療遺傳性脫髓鞘、多發(fā)性硬化的少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。由于腦組織中含有多種神經(jīng)細(xì)胞，同時成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞不再具有分裂增殖能力，為分裂終期細(xì)胞[1]，因此如何獲取純化、足量的少突膠質(zhì)細(xì)胞是深入研究的前提。少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法有震蕩法[2]、免疫“淘選”法[3]和神經(jīng)干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)[4]等，但前者獲取的細(xì)胞數(shù)量少，而后兩者要求的條件較高、花費昂貴、操作過程復(fù)雜。近年來多采用振蕩法結(jié)合差速貼壁法，但培養(yǎng)周期較長[5]。因此，獲得一種簡單、經(jīng)濟、高效的少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法具有重要意義。

視神經(jīng)是具有中樞神經(jīng)特征的周圍神經(jīng)，不含神經(jīng)元胞體和室管膜細(xì)胞[6]，主要有Ⅰ、Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞3種大膠質(zhì)細(xì)胞，是研究膠質(zhì)細(xì)胞在體外發(fā)育的極好材料。本實驗在既往新生大鼠視神經(jīng)組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)上，經(jīng)過探索，對其加以改良，方法簡單，經(jīng)濟，可獲得實驗用足量純化的少突膠質(zhì)細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清(foetal bovine serum，F(xiàn)BS)、亞硒酸鈉、谷氨酰胺、甲狀腺素、轉(zhuǎn)鐵蛋白(美國，Sigma公司)；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)/F12培養(yǎng)基(美國，HyClone公司)；髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)抗體、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)試劑盒(武漢博士德生物制劑公司)。CO2培養(yǎng)箱(日本，SANYO Electric CO.Ltd)、倒置相差顯微鏡(德國，LEICA公司)。新生2 d SD大鼠[大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，SCXK-(遼)-2008-0002]。培養(yǎng)液均以DMEM/F12培養(yǎng)基配制，加入100 U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素。培養(yǎng)用液配方[7]見表1。

表1 培養(yǎng)用液配方

1.2 方法

1.2.1 視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 新生2 d SD大鼠，75%乙醇浸泡2 min后，立即移進超凈臺，無菌條件下取雙側(cè)視神經(jīng)，置于無菌培養(yǎng)皿中，剔除血管，預(yù)冷(4℃)的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3遍。常溫下0.125%胰酶消化3～5 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液終止消化，將組織塊移入預(yù)先涂有多聚賴胺酸的培養(yǎng)皿中(直徑3.5 cm)，每皿3對神經(jīng)，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液(使組織塊接觸到培養(yǎng)液，又不懸浮于培養(yǎng)液，約400μL)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第4天時，更換為化學(xué)限定培養(yǎng)液A(約400 μL)；每周更換培養(yǎng)液2次。約第10天時，更換為化學(xué)限定培養(yǎng)液B(約600μL)，此時細(xì)胞生長成熟，1 d后進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.2.2 少突膠質(zhì)細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定及計數(shù)

細(xì)胞生長至11 d時，原位進行細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定，按照SABC試劑說明進行。一抗為1∶100 MBP抗體，蘇木素和伊紅復(fù)染，乙醇脫水，50%無水乙醇及50%甘油混合液封閉培養(yǎng)皿，4℃保存。每皿計數(shù)500個細(xì)胞中MBP陽性細(xì)胞個數(shù)，計算MBP陽性細(xì)胞百分率。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)3個平行培養(yǎng)皿。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件，每次MBP陽性細(xì)胞百分率以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，3次間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察 視神經(jīng)組織塊24 h開始貼壁，48～72 h可見組織邊緣游出少量細(xì)胞，主要為梭形。9～10 d，細(xì)胞基本全部從組織塊中游離出來，平鋪于皿底，組織塊呈透明狀，此時改用化學(xué)限定培養(yǎng)液B培養(yǎng)后部分細(xì)胞死亡。11 d左右獲得的細(xì)胞胞體基本呈圓形或多角形，直徑6～10μm，細(xì)胞核較大，胞質(zhì)少，突起豐富(圖1)。每皿計數(shù)細(xì)胞數(shù)為(6～8)×105個。

2.2 少突膠質(zhì)細(xì)胞免疫化學(xué)染色 培養(yǎng)的細(xì)胞行MBP免疫化學(xué)染色，90%以上為MBP陽性細(xì)胞(圖2)，異質(zhì)細(xì)胞少。

圖1 培養(yǎng)第12天，純化的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞(×100)

圖2 培養(yǎng)第12天，MBP細(xì)胞免疫化學(xué)染色陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞(×200)

2.3 培養(yǎng)方法的可重復(fù)性 3次培養(yǎng)細(xì)胞的MBP細(xì)胞免疫化學(xué)染色陽性細(xì)胞百分率分別為(95.33± 3.3)%、(94.33±2.2)%及(97.13±2.2)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

視神經(jīng)是由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體發(fā)出的軸索和視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，不含神經(jīng)元胞體和室管膜細(xì)胞，成分單一，便于研究[6]。視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞兩大類，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞分為Ⅰ、Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞雖然均起源于神經(jīng)外胚葉的神經(jīng)上皮細(xì)胞，但2種細(xì)胞來自不同的分化譜系，Ⅰ型星形膠質(zhì)細(xì)胞由Ⅰ型星形膠質(zhì)細(xì)胞譜系分化，少突膠質(zhì)細(xì)胞和Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞是由一種普通雙向潛能的少突膠質(zhì)細(xì)胞/Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligodendrocyte/type-2 astrocyte progenitor cells，O-2A)分化的。少突膠質(zhì)細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成起著決定性作用，而Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起總是圍繞著郎飛結(jié)，因此O-2A譜系可能對髓鞘形成有特殊的作用[1]。

體外分離培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，取材時間最好放在其前體細(xì)胞充分發(fā)育之后，但是要在活躍的髓鞘形成期之前，以保證其能在體外繼續(xù)發(fā)育。大鼠出生后約1周，少突膠質(zhì)細(xì)胞即逐漸成熟[1]，因此采用新生2 d的SD大鼠視神經(jīng)進行原代培養(yǎng)。彭錫嘉等[7]采用視神經(jīng)組織塊加雙蓋玻片法培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞，將視神經(jīng)剪碎使細(xì)胞容易從組織中游離，但對脆弱的視神經(jīng)損傷較大，操作也不容易。由于新生大鼠視神經(jīng)組織較輕，直接加入培養(yǎng)液后，組織塊容易懸浮起來；加雙蓋玻片可幫助神經(jīng)組織貼壁，但蓋玻片在一定程度阻礙了組織塊與培養(yǎng)液的接觸，不利于細(xì)胞生長；如果選用膜性的蓋玻片，成本又很高。本實驗不對組織塊進行剪碎，減少對其損傷，只對組織塊在室溫下稍做消化(3～5 min)后，直接接種于培養(yǎng)皿中，加入少量的培養(yǎng)液，使組織塊既接觸到培養(yǎng)液又不懸浮于培養(yǎng)液，細(xì)胞可接觸培養(yǎng)皿底貼壁生長。

前O-2A祖細(xì)胞和O-2A祖細(xì)胞在血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3，NT-3)、胰島素樣生長因子-1(insulin like growth facto-1，IGF-1)等肽類生長因子的作用下可大量增殖，其中PDGF可以刺激少突膠質(zhì)前體細(xì)胞合成DNA，bFGF、NT-3和IGF-1可促進細(xì)胞周期循環(huán)，阻止細(xì)胞分化[8]。星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)可以分泌PDGF和bFGF[9]，其條件培養(yǎng)液具有明顯的促神經(jīng)生長的作用[10]。因此，盡管血清可誘導(dǎo)O-2A向Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，但本實驗在視神經(jīng)培養(yǎng)的早期仍使用了含有血清的培養(yǎng)液，但逐漸降低至僅含0.5%胎牛血清的化學(xué)限定性培養(yǎng)液。一方面保證一定數(shù)量的星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活，分泌細(xì)胞因子促進O-2A增殖；另一方面盡可能減少O-2A向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。待獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞后，改為無胎牛血清化學(xué)限定性培養(yǎng)液繼續(xù)進行培養(yǎng)，此時O-2A在無胎牛血清培養(yǎng)基中，在甲狀腺素、腐胺、黃體酮及微量元素硒的作用下可向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。由于成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞為分裂終期細(xì)胞，不再具有分裂增殖能力，因此在無胎牛血清條件下生存不受影響；而星形膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞具有分裂增殖能力，在此條件下很難存活[6]。在更換培養(yǎng)液第2天即可觀察到部分細(xì)胞死亡，考慮為死亡的星形膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，從而實現(xiàn)了對培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞的純化。

體外培養(yǎng)條件下的少突膠質(zhì)細(xì)胞系的發(fā)育進展按抗原表達、形態(tài)和功能分為前O-2A祖細(xì)胞、O-2A祖細(xì)胞、原少突膠質(zhì)細(xì)胞、未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞5個階段[11]。少突膠質(zhì)細(xì)胞在形成髓鞘前1～2 d將表達MBP[12]，這種蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)只存在于少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體的胞漿面[13]。Mirsky等[14]觀察到，體外培養(yǎng)的視神經(jīng)在5～6 d時才有MBP陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)。本實驗方法所培養(yǎng)的細(xì)胞在第11天時，90%以上為MBP陽性細(xì)胞，提示均為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量每皿可達(6～8)×105個，足夠一般細(xì)胞生物學(xué)實驗使用，且方法簡便、穩(wěn)定，易于推廣。

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Modified method for ratoptic nerve oligodendrocytes in vitro culture

WANG Xiaohong1，WANG Suping1，CHE Juhua2，WANG Hong3，WANG Tao4，ZHU Yanling5
(1.Department of Neurology，Dalian Municipal Central Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian Liaoning 116033，China；2.Dalian Medical University，Dalian Liaoning 116044 China；3.Department of Neurosurgery，Dalian Municipal Central Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian Liaoning 116033，China；4.Department of Rehabilitation Medicine，Dalian Municipal Central Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian Liaoning 116033，China；5.Department of Neurology，the Third People′s Hospital of Dalian，Dalian Liaoning 116033，China)

ObjectiveTo improve the pastmethod for in vitro culture of neonatal rat optic nerve oligodendrocytes.MethodsSix optic nerves of newborn rats were placed in poly-lysine precoated dish(diameter 3.5 cm)，cultured with 400μL basic culturemedium for 3 days，and then replaced by 400μL chemically defined culturemedium containing 3%foetal bovine serum(FBS). For about the 10th days，culturemedium was replaced by 600μL chemically defined culturemedium without FBS.At the 11st days，immunocytochemistry with myelin basic protein(MBP)was used to identify oligodendrocyte，and the percentage of positive cellswas calculated.Oligodendrocyte in vitro culture with themethod was repeated three times，analysis of variance was used to evaluate the stability of the improved method.ResultsFor the 11st cultured days，number of cells in per dish was up to(6—8)×105，more than 90%cellswere positive with MBP immunocytochemistry.There was no statistical difference among the percentage ofMBP immunocytochemistry positive cells of the three times(P＞0.05)of culture.ConclusionHigher purified and enough for cell biology experiments mature oligodendrocytes can be obtained with the improvedmethod for in vitro culture of neonatal rat optic nerve oligodendrocytes.This improved method is relatively easy and stable，compared with the othermethods for oligodendrocytes culture.

Optic nerve；Oligodendrocyte；Cell culture

R322.85－332

A

2095-3097(2014)06-0330-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2014.06.003

2014-09-25 本文編輯:徐海琴)

116033遼寧大連，大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(王曉虹，王蘇平)，綜合神經(jīng)外科(王 虹)，康復(fù)醫(yī)學(xué)科(汪濤)；116044遼寧大連，大連醫(yī)科大學(xué)(車菊華)；116033遼寧大連，大連市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(朱艷玲)

王蘇平，E-mail:wangsuping＠m(xù)edmail.com.cn