李璐瑤，杜鑫，包鵬云，張叢堯，曹淑青，馬悅欣

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023)

酵母通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)、核酸、維生素和多糖的良好來(lái)源［1-2］。海洋紅酵母Rhodotorula sp.可以替代單胞藻進(jìn)行刺參浮游幼體的培育［3］;德巴利酵母 Debaryomyces sp.MY3、克魯維酵母Kluyveromyces sp.MY32、蟲(chóng)道酵母Ambrosiozyma sp.MY33 以不超過(guò)50%的比例替代球等鞭金藻Isochrysis galbana，對(duì)海灣扇貝Argopecten irradians 幼貝的生長(zhǎng)和存活影響不大［4］;漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii HF1可提高鱸Dicentrarchus labrax 幼體的存活率［5］;沼澤生紅冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum 能夠促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei 的生長(zhǎng)［6］;清酒假絲酵母Candida sake S165、漢遜德巴利酵母S8和熱帶假絲酵母Candida tropicalis S186是印度明對(duì)蝦Fenneropenaeus indicus 有效的免疫增強(qiáng)劑［2，7］。

刺參Apostichopus japonicus是中國(guó)北方地區(qū)重要的海珍品養(yǎng)殖種類。由于養(yǎng)殖密度的迅速增加和不規(guī)范養(yǎng)殖，使刺參病害頻發(fā)，嚴(yán)重制約了刺參養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［8-12］。使用益生菌防止刺參疾病發(fā)生是替代抗生素的有效方法之一。薛德林等［13］研究表明，當(dāng)海洋膠紅酵母Rhodotorula mucilaginosa(濃度為1 ×1010CFU/mL)日投喂量為10 mL/m3(水體)時(shí)，試驗(yàn)組刺參幼體爛胃病的發(fā)病率顯著低于對(duì)照組。從天然海域健康刺參腸道分離的梅奇酵母Metschnikowia sp.C14 體外可抑制刺參病原菌黃海希瓦氏菌Shewanella marisflavi AP629和燦爛弧菌Vibrio splendidus NB13 的生長(zhǎng)［14］。Liu等［15］將梅奇酵母C14 添加到刺參基礎(chǔ)餌料中進(jìn)行投喂試驗(yàn)，結(jié)果表明，C14 菌株可刺激幼參的免疫反應(yīng)，提高其抗病力。有益酵母菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)大多使用價(jià)格較高的葡萄糖、酵母膏和蛋白胨等培養(yǎng)基。本試驗(yàn)中，以成本低廉且適用于工業(yè)生產(chǎn)的糖蜜、豆粕粉和玉米粉為營(yíng)養(yǎng)要素，優(yōu)化梅奇酵母C14 的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，旨在為該菌株的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株梅奇酵母C14 從健康刺參腸道分離獲得［14-15］。

培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基(YPD)，其包含蛋白胨20 g、酵母粉10 g、葡萄糖20 g、陳海水1000 mL，自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基包含豆粕粉70 g、玉米粉50 g、糖蜜50 g、陳海水1000 mL，pH 為5。豆粕粉和玉米粉與一定量的海水?dāng)嚢杈鶆蚝笥?0 ℃水浴中靜置1 h［16］。糖蜜的處理參考文獻(xiàn)［17］中的方法。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化 將梅奇酵母C14 于YPD 斜面活化后，接入5 mL 液體種子培養(yǎng)基中，于25 ℃下?lián)u床培養(yǎng)(150 r/min)20 h，再將其以4%的接種量接入盛有25 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶(250 mL，下同)中，25 ℃下?lián)u床培養(yǎng)(150 r/min)24 h，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌總數(shù)［18］。

(1)單因素試驗(yàn)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50、60、70、80、90 g/L 共5 個(gè)濃度的豆粕粉(每一濃度設(shè)3 個(gè)平行，下同)，選擇其最優(yōu)質(zhì)量濃度;在豆粕粉最優(yōu)質(zhì)量濃度基礎(chǔ)上改變玉米粉含量為30、40、50、60、70 g/L 共5 個(gè)濃度，選擇其最優(yōu)質(zhì)量濃度;在豆粕粉和玉米粉最優(yōu)質(zhì)量濃度基礎(chǔ)上改變糖蜜含量為30、40、50、60、70 g/L 共5 個(gè)濃度，選擇其最優(yōu)質(zhì)量濃度。

(2)正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇豆粕粉、玉米粉、糖蜜和pH 進(jìn)行4 因素3 水平L9(34)的正交試驗(yàn)(表1)，共9 個(gè)處理組，每組設(shè)3 個(gè)平行，測(cè)定不同處理組酵母菌的生長(zhǎng)情況。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of a orthogonal test

1.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化在正交試驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，進(jìn)行梅奇酵母C14 發(fā)酵條件的優(yōu)化。種子液制備同“1.2.1”。

(1)溫度對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響。將液體種子以4%接種量接入25 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于20、25、30 ℃(每一溫度設(shè)3 個(gè)平行)下?lián)u床培養(yǎng)(150 r/min)24 h，計(jì)數(shù)酵母菌總數(shù)，確定該菌株的最適生長(zhǎng)溫度。

(2)搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響。將液體種子以4%接種量接入25 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，在最適溫度下分別以120、150、180、210 r/min(每一轉(zhuǎn)速設(shè)3 個(gè)平行)搖床培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)酵母菌總數(shù)，確定最適搖瓶轉(zhuǎn)速。

(3)接種量對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響。將液體種子以2%、3%、4%、5%和6%的接種量(每一接種量設(shè)3 個(gè)平行)接入25 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于最適溫度和搖瓶轉(zhuǎn)速條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)酵母菌總數(shù)，確定最適接種量。

(4)裝液量對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響。將液體種子以最適接種量接入15、25、35 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基(每一裝液量設(shè)3 個(gè)平行)中，于最適溫度和搖瓶轉(zhuǎn)速條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)酵母菌總數(shù)，確定最適裝液量。

1.2.3 梅奇酵母C14 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將液體種子以最適接種量接入裝有最適裝液量的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，在最適搖瓶轉(zhuǎn)速和溫度條件下培養(yǎng)，每隔4 h 計(jì)數(shù)酵母菌總數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan 多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn) 不同質(zhì)量濃度的豆粕粉、玉米粉和糖蜜對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響如圖1所示。發(fā)酵液中C14 菌密度隨著豆粕粉、玉米粉和糖蜜質(zhì)量濃度的升高均呈先上升后下降的趨勢(shì)。從圖1可見(jiàn):當(dāng)豆粕粉質(zhì)量濃度為70 g/L 時(shí)，C14 菌密度最高，且顯著高于其他濃度組(P＜0.05);不同玉米粉質(zhì)量濃度對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)，當(dāng)玉米粉質(zhì)量濃度為50 g/L 時(shí)，C14 菌密度稍高;當(dāng)糖蜜質(zhì)量濃度為60 g/L 時(shí)，C14 菌密度最高(8.75 ×108cells/mL)，且顯著高于其他濃度組(P＜0.05)。

2.1.2 正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)豆粕粉質(zhì)量濃度、玉米粉質(zhì)量濃度、糖蜜質(zhì)量濃度和pH 值4 因素3 水平的正交試驗(yàn)(表2)。從表2可見(jiàn)，影響C14 菌株生長(zhǎng)的主次因素順序?yàn)槎蛊煞郏咎敲郏緋H ＞玉米粉。方差分析結(jié)果表明(表3)，A、D 因素對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響均達(dá)到極顯著水平，C 因素對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響達(dá)到顯著水平。因此，C14 菌株生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方組合為A2B1C2D3，即70 g/L 豆粕粉，40 g/L 玉米粉，60 g/L 糖蜜，pH 為6，培養(yǎng)24 h 時(shí)的C14 菌密度達(dá)1.09 ×109cells/mL。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 溫度對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響 溫度對(duì)C14菌株生長(zhǎng)有顯著影響，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，C14 菌密度最高，且顯著高于其他溫度組(P＜0.05)(圖2)。因此，在本試驗(yàn)條件下，確定最佳發(fā)酵溫度為25 ℃。

圖1 豆粕粉、玉米粉、糖蜜對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of soybean meal，corn mealon，and molasses on growth of strain C14

表2 C14 菌株生長(zhǎng)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The growth of strain C14 and design in the orthogonal experiments

2.2.2 轉(zhuǎn)速對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響 隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的增大，C14 菌密度顯著提高，但進(jìn)一步提高搖床轉(zhuǎn)速，C14 菌密度則開(kāi)始逐漸下降，當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min 時(shí)，C14 菌密度達(dá)到最高，且顯著高于其他搖瓶轉(zhuǎn)速組(P＜0.05)(圖2)。因此，在本試驗(yàn)條件下，確定最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.2.3 接種量對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響 接種量對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)有顯著影響，當(dāng)接種量為3%、4%時(shí)，C14 菌密度均較高，且顯著高于其他接種量組(P＜0.05)，當(dāng)接種量超過(guò)5%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到抑制(圖2)。因此，在本試驗(yàn)條件下，從經(jīng)濟(jì)效益考慮，確定最佳接種量為3%。

表3 試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.3 The results of ANOVA

2.2.4 裝液量對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響 C14 菌株的生長(zhǎng)隨裝液量的增加而增加，當(dāng)裝液量為25 mL時(shí)，C14 菌密度最高，且顯著高于其他裝液量組(P＜0.05)，當(dāng)裝液量超過(guò)25 mL 時(shí)，菌株的生長(zhǎng)反而受到抑制(圖2)。因此，在本試驗(yàn)條件下，確定最佳裝液量為25 mL。

2.3 C14 菌株的生長(zhǎng)曲線

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為0 ～8 h 時(shí)C14 菌體生長(zhǎng)緩慢，8 ～24 h 時(shí)菌體密度呈指數(shù)增加，28 h 時(shí)菌體密度最高(1.26 ×109cells/mL)。因此，在本試驗(yàn)條件下，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間為28 h。

圖2 培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量對(duì)C14 菌株生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of temperature，shaking speed，inoculum ratio，and medium volume on growth of strain C14

圖3 C14 菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of strain C14

3 討論

豆粕粉中蛋白質(zhì)含量超過(guò)40%，且富含多種氨基酸。豆粕為工業(yè)生產(chǎn)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的最佳氮源［19］。玉米漿含有豐富的氨基酸、還原糖、磷、微量元素和生長(zhǎng)素，很容易被微生物吸收利用。玉米漿對(duì)水產(chǎn)用益生菌地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis D1 的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，適宜添加量為1.5%［20］。糖蜜是制糖工業(yè)的主要副產(chǎn)品，含豐富的糖類、氨基酸、有機(jī)酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽和色素等，是發(fā)酵工業(yè)中常用的廉價(jià)原料。海洋紅酵母可利用糖蜜作為其生長(zhǎng)較適宜的碳源［21］。本試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中含豆粕粉70 g/L、玉米粉40 g/L、糖蜜60 g/L，有利于C14菌株的生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h 后獲得的菌密度(1.09 ×109cells/mL)遠(yuǎn)高于膠紅酵母HN -3在葡萄糖、蛋白胨和酵母膏組成的優(yōu)化培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48 h 的菌密度(4.80 ×107cells/mL)［22］。

本試驗(yàn)中，C14 菌株生長(zhǎng)的最適溫度為25 ℃，溫度偏低可能與菌株來(lái)源有關(guān)。刺參通常生活在低溫環(huán)境中，其體內(nèi)的酵母菌為適應(yīng)其生存環(huán)境而形成與陸地酵母菌不同的生活習(xí)性。當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min 時(shí)，C14 菌株的生物量最高，可能是低轉(zhuǎn)速使三角瓶?jī)?nèi)溶解氧含量減少，而高轉(zhuǎn)速又導(dǎo)致瓶中的剪切應(yīng)力增大，轉(zhuǎn)速過(guò)高或過(guò)低時(shí)均使菌體生長(zhǎng)緩慢。接種量與菌株的生長(zhǎng)周期有關(guān)，接種量低，延滯期長(zhǎng)，發(fā)酵周期延長(zhǎng);接種量高，菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的競(jìng)爭(zhēng)力過(guò)大，菌體因營(yíng)養(yǎng)不足而死亡，C14 菌株生長(zhǎng)的最適接種量為3%。裝液量可反映搖瓶?jī)?nèi)溶解氧含量的多少，裝液量少，瓶?jī)?nèi)溶解氧含量多;裝液量多時(shí)可導(dǎo)致供氧不足，影響菌體的生長(zhǎng)，C14菌株生長(zhǎng)的最適裝液量為25 mL。梁曉華等［23］研究表明，250 mL 三角瓶中培養(yǎng)基的裝液量為10 mL 時(shí)最有利于海洋紅酵母Y2 的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，在優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下培養(yǎng)，C14 菌株的最大菌密度 為1.26 × 109cells/mL，高于海洋紅酵母Rhodotorula benthica和Rhodotorula sp.RH1在優(yōu)化的培養(yǎng)基(蔗糖/葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等)和發(fā)酵條件下培養(yǎng)獲得的最大菌密度(9.70 ×108cells/mL、1.05×109cells/mL)［24-25］。因此，以豆粕粉、玉米粉和糖蜜廉價(jià)原料組成的培養(yǎng)基有利于C14菌株的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果可為刺參內(nèi)源益生菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

［1］Brown M R，Barrett S M，Volkman J K，et al.Biochemical composition of new yeasts and bacteria evaluated as food for bivalve aquaculture［J］.Aquaculture，1996，143:341 -360.

［2］Sajeevan T P，Philip R，Singh I S B.Immunostimulatory effect of a marine yeast Candida sake S165 in Fenneropenaeus indicus［J］.Aquaculture，2006，257:150 -155.

［3］趙玉明，毛玉澤.海洋酵母培育仿刺參Apostichopus japonicus 浮游幼體研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2009，11(3):71 -75.

［4］蔡詩(shī)慶，孫世春.三株海洋酵母投喂海灣扇貝幼貝效果的研究［J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，35(6):955-960.

［5］Tovar D，Zambonino J，Cahu C，et al.Effect of live yeast incorporation in compound diet on digestive enzyme activity in sea bass(Dicentrarchus labrax)larvae［J］.Aquaculture，2002，204:113-123.

［6］Yang S P，Wu Z H，Jian J C，et al.Effect of marine red yeast Rhodosporidium paludigenum on growth and antioxidant competence of Litopenaeus vannamei［J］.Aquaculture，2010，309:62 -65.

［7］Sarlin P J，Philip R.Efficacy of marine yeasts and baker's yeast as immunostimulants in Fenneropenaeus indicus:a comparative study［J］.Aquaculture，2011，321:173 -178.

［8］馬悅欣，徐高蓉，常亞青，等.大連地區(qū)刺參幼參潰爛病細(xì)菌性病原的初步研究［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21(1):13-17.

［9］馬悅欣，徐高蓉，張恩鵬，等.仿刺參幼參急性口圍腫脹癥的細(xì)菌性病原［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2006，30(3):378 -382.

［10］王印庚，榮小軍，張春云，等.養(yǎng)殖海參主要疾病及防治技術(shù)［J］.海洋科學(xué)，2005，29(3):1 -7.

［11］Deng H，He C B，Zhou Z C，et al.Isolation and pathogenicity of pathogens from skin ulceration disease and viscera ejection syndrome of the sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Aquaculture，2009，287:18 -27.

［12］Li H，Qiao G，Li Q，et al.Biological characteristics and pathogenicity of a highly pathogenic Shewanella marisflavi infected sea cucumber(Apostichopus japonicus)［J］.Journal of Fish Disease，2010，33:865 -877.

［13］薛德林，胡江春，王國(guó)安，等.海洋膠紅酵母、光合細(xì)菌、生化黃腐酸在海參育苗和養(yǎng)成中的應(yīng)用效果［J］.腐殖酸，2009，22(4):19 -24.

［14］李明，馬悅欣，劉志明，等.刺參體內(nèi)外酵母菌組成及其拮抗活性的研究［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(5):436-440.

［15］Liu Z M，Ma Y X，Yang Z P，et al.Immune responses and disease resistance of the juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus induced by Metschnikowia sp.C14［J］.Aquaculture，2012，368:10 -18.

［16］巴尼特J A，佩恩R W，亞羅D.酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)［M］.胡瑞卿，譯.青島:青島海洋大學(xué)出版社，1991:29.

［17］朱曉立，裘暉，鄧毛程，等.紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)蝦青素的培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，32(2):61 -64.

［18］沈萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:高等教育出版社，2007:51 -55.

［19］元福杰，王印庚，廖梅杰，等.一株刺參益生菌的發(fā)酵配方及其發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.漁業(yè)現(xiàn)代化，2012，39(3):40 -45.

［20］楊鶯鶯，李卓佳，陳永青，等.益生菌D-1 液體發(fā)酵工藝的研究［J］.南方水產(chǎn)，2005(6):44 -49.

［21］張超.補(bǔ)料分批培養(yǎng)海洋紅酵母的研究［J］.四川輕化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，13(2):26 -30.

［22］周鮮嬌，田麗，梁如璞，等.一株海洋紅酵母的鑒定及其培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2012，31(2):107 -110.

［23］梁曉華，楊鶯鶯，楊鏗，等.海洋紅酵母Y2 發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素條件的研究［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23(12):1068 -1073.

［24］童應(yīng)凱，韋東勝，劉婷，等.海洋紅酵母培養(yǎng)條件的研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27(8):75 -79.

［25］楊鶯鶯，陳永青，楊鏗，等.海洋紅酵母RH1 菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究［J］.南方水產(chǎn)科學(xué)，2012，8(1):67 -74.