馬辰，王福景，李霞，秦艷杰，李雅娟

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023)

泥鰍Misgurnus anguillicaudatus 隸屬于鯉形目、鰍科，是中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，其肉鮮味美、營養(yǎng)豐富，不僅是良好的食材，而且還可入藥，泥鰍有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)腎生精之功效。對于泥鰍的生物學(xué)研究多集中于生長繁殖［1-2］、遺傳育種［3-4］等方面。近十年來，國內(nèi)外對魚類細(xì)胞系的建立和應(yīng)用的研究很多，眾多淡水魚類組織細(xì)胞系相繼成功建立，并被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖魚類疾病的診斷、病理學(xué)研究和環(huán)境監(jiān)測方面［5-6］。Yan等［7］建立了金魚Carassius auratus 尾鰭細(xì)胞系CFTF，病毒敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該細(xì)胞系對蛇頭魚彈狀病毒(SHRV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(CCV)易感;肖藝等［8］建立了錦鯉Cryprinus carpiod 鰭條組織細(xì)胞系Koi -Fin，該細(xì)胞系對錦鯉皰疹病毒(KHV)敏感;譚鳳霞等［9］利用草魚CIK 細(xì)胞系測定了鎘和鉻的毒性。但有關(guān)泥鰍鰭細(xì)胞系的建立目前尚未見報(bào)道，為此，本研究中建立了泥鰍鰭細(xì)胞系，并研究了其細(xì)胞系的特性。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用泥鰍于2012年5月購自大連市農(nóng)貿(mào)市場，全長為8 ～10 cm，體質(zhì)量為5 ～7 g，在實(shí)驗(yàn)室室溫條件下暫養(yǎng)一周后用于試驗(yàn)。暫養(yǎng)期間，投喂人工配合餌料，不間斷充氣，每天換水一次。

試劑DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗溶液均為Hyclone 公司產(chǎn)品;人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、Ⅰ型胰島素樣生長因子(IGF - Ⅰ)均為Peprotech 公司產(chǎn)品;硫酸軟骨素為Wolsen 公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 參考李霞等［10］、郭瑩等［11］對大瀧六線魚組織的原代培養(yǎng)方法，將泥鰍在含高雙抗(1000 IU/mL 青霉素，1000 μg/mL 鏈霉素)曝氣的水中暫養(yǎng)24 h 后，用1‰的苯甲醇麻醉，在超凈工作臺(tái)上剪取泥鰍鰭組織，先后用體積分?jǐn)?shù)為10%的碘伏浸泡15 min 以及青霉素和鏈霉素的混合液(500 IU/mL 青霉素，500 μg/mL 鏈霉素)浸泡30 min，再用PBS 漂洗兩遍后，剪成1 mm3左右的塊狀并均勻接種于底面積為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在CO2培養(yǎng)箱(5%，25 ℃)中正置干貼24 h后補(bǔ)加培養(yǎng)液至5 mL/瓶，啟動(dòng)原代培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層。所用培養(yǎng)液為DMEM/F12，并添加體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清(FBS)、10 ng/mL 人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、20 ng/mLⅠ型胰島素樣生長因子(IGF -Ⅰ)和10 μg/mL 硫酸軟骨素。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 待細(xì)胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶溶液1 mL，待細(xì)胞變圓后吸掉胰蛋白酶溶液，輕磕細(xì)胞培養(yǎng)瓶。將之前吸出的培養(yǎng)液加回，用吸管吹打，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液平均分裝到兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，并向兩個(gè)培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加培養(yǎng)液至5 mL/瓶，在CO2培養(yǎng)箱(5%，25 ℃)中培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層后繼續(xù)用此方法傳代。所用培養(yǎng)液配方同原代培養(yǎng)，待傳代至30 代后去掉生長因子，所用培養(yǎng)液為20%FBS-DMEM/F12。

1.2.3 細(xì)胞超低溫保存與復(fù)蘇 配制含20%FBS、60% DMEM/F12和20%二甲基亞砜的細(xì)胞凍存液，置于冰箱(4 ℃)中過夜保存?zhèn)溆谩Ｈ?5 代生長旺盛的細(xì)胞，用0.25%的胰酶溶液消化使細(xì)胞重懸后，以1500 r/min 離心5 min，棄上清，向沉淀中加入1 mL 細(xì)胞凍存液，重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0 ×106cells/mL，并轉(zhuǎn)至凍存管中。置于冰箱中逐漸降溫:4 ℃下放置30 min，-20 ℃下放置2 h、-80 ℃下放置24 h，最后放入液氮容器(-196 ℃)中保存。

取保存在液氮中30 d 的細(xì)胞，在40 ℃水中解凍，待細(xì)胞凍存液融化后轉(zhuǎn)入25 ℃水浴中，然后在超凈工作臺(tái)上將細(xì)胞凍存液轉(zhuǎn)入到離心管中，并加入等量DMEM/F12 培養(yǎng)基，以1500 r/min 離心5 min，棄上清，用20% FBS -DMEM/F12 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入到底面積為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)加培養(yǎng)液至5 mL/瓶，在CO2培養(yǎng)箱(5%，25 ℃)中培養(yǎng)24 h 后全量換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

取200 μL 細(xì)胞懸液加入等量胎盤藍(lán)染色，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率:

存活率=存活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 染色體分析 待泥鰍鰭細(xì)胞傳至40 代時(shí)，取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞，加入秋水仙素，使秋水仙素終濃度達(dá)到1 μg/mL，混勻，置于CO2培養(yǎng)箱(5%，25 ℃)中繼續(xù)培養(yǎng)3 ～5 h 后，用0.25%的胰酶溶液消化使細(xì)胞重懸，轉(zhuǎn)入離心管中，以1500 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞。用0.075 mol/L KCl 溶液低滲40 min，用Carnoy 固定液固定15 min，固定3次后滴片，干燥后用Giemsa 染液染色，在高倍油鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。

1.2.5 細(xì)胞生長曲線及群體倍增時(shí)間的測定 待泥鰍鰭細(xì)胞傳代至40 代時(shí)，用0.25% 胰酶溶液消化使細(xì)胞重懸，按每孔500 μL 接種于24 孔細(xì)胞板中，接種 密 度 為(3.0 × 104)～(5.0 × 104)cells/mL，置于CO2培養(yǎng)箱(5%，25 ℃)中培養(yǎng)，每24 h 取3 孔細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，連續(xù)進(jìn)行7 d。以培養(yǎng)時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度(cells/mL)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長曲線。根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞的群體倍增時(shí)間(t'):

其中，Nt為時(shí)間t 時(shí)的細(xì)胞數(shù)，N0為初始接種細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 泥鰍鰭細(xì)胞系對鯉春病毒血癥病毒(SVCV)和魚類諾達(dá)病毒(YGNNV)的敏感性試驗(yàn) 取60 代生長旺盛的泥鰍鰭細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，用PBS 漂洗兩遍，分別向瓶內(nèi)加入0.1 mL SVCV病毒液和YGNNV 病毒液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使病毒液均勻覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，放回到CO2培養(yǎng)箱(5%，25 ℃)中繼續(xù)培養(yǎng)。待病毒吸附2 h 后，吸去病毒液，加入20% FBS -DMEM/F12 培養(yǎng)液至5 mL/瓶，置于CO2培養(yǎng)箱(5%，25 ℃)中繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置對照組，以0.1 mL DMEM/F12培養(yǎng)基代替病毒液，其他步驟與上述相同。逐日觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并拍照記錄細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。如果未出現(xiàn)CPE 或CPE 現(xiàn)象不明顯，則每7 d 盲傳一次細(xì)胞，直至出現(xiàn)明顯的CPE 現(xiàn)象。

1.2.7 SVCV 病毒在泥鰍鰭細(xì)胞系上的滴度測定 取60 代生長旺盛的泥鰍鰭細(xì)胞，用0.25%的胰酶溶液消化使細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至(1.0 ×105)～(2.0 ×105)cells/mL，按每孔0.2 mL 接種于96 孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱(5%，25 ℃)中培養(yǎng)，48 h 后吸去原培養(yǎng)液，接種病毒懸液，測定病毒滴度。病毒懸液按10 倍系列稀釋，接種于上述長滿細(xì)胞單層的96 孔板中，每個(gè)稀釋度為8孔，置于CO2培養(yǎng)箱(5%，25 ℃)中繼續(xù)培養(yǎng)，并逐日觀察CPE 的出現(xiàn)情況。表示病毒滴度的TCID50值按照Reed等［12］的公式計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)結(jié)果

泥鰍鰭組織接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，培養(yǎng)48 ～60 h 后有細(xì)胞從組織塊中遷出，并呈纖維狀，6 ～7 d 后組織塊周圍形成單層(圖1)，培養(yǎng)30 ～32 d后細(xì)胞即可長滿培養(yǎng)瓶瓶底，形成單層。

圖1 泥鰍鰭組織塊周圍的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(7 d)Fig.1 Fibroblast－like cells around loach(7 d)

2.2 傳代培養(yǎng)及細(xì)胞系的建立

首次傳代后，細(xì)胞6 ～7 d 后即可長滿培養(yǎng)瓶瓶底并呈纖維樣，連續(xù)傳代10 代后，細(xì)胞增殖速度加快，2 ～3 d 即可長滿單層。細(xì)胞生長穩(wěn)定，為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。目前，泥鰍鰭細(xì)胞已傳代至63 代(圖2)。

圖2 第63 代泥鰍鰭細(xì)胞Fig.2 Fin cells in generation 63 of loach

2.3 細(xì)胞系的保存

對凍存在液氮容器(-196 ℃)中30 d 的鰭細(xì)胞復(fù)蘇后再培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)均一，仍為成纖維細(xì)胞樣，3 ～4 d 長滿單層，并且可以繼續(xù)傳代。存活率為81.31% ±1.46%。

2.4 染色體分析

對培養(yǎng)40 代的鰭細(xì)胞進(jìn)行染色體滴片，統(tǒng)計(jì)100 個(gè)形態(tài)清晰、分散好的中期分裂相，染色體數(shù)目分布從43 到52 不等，但分裂相染色體數(shù)目出現(xiàn)頻率最高為50 條(圖3)，染色體數(shù)目為50 的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的86%(圖4)。

2.5 泥鰍鰭細(xì)胞的生長曲線

從第40 代泥鰍鰭細(xì)胞的生長曲線(圖5)可以看出，細(xì)胞在傳代后的前2 d 為潛伏期，從第3天開始進(jìn)入對數(shù)生長期，第4天～第6天進(jìn)入穩(wěn)定期，第6天后進(jìn)入衰落期。通過公式計(jì)算得到，第40 代泥鰍鰭細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為56.85 h，表明泥鰍鰭細(xì)胞生長繁殖能力旺盛。

圖3 泥鰍鰭細(xì)胞40 代染色體中期分裂相Fig.3 Metaphase chromosomes in fin cells from generation 40 of loach

圖4 第40 代泥鰍鰭細(xì)胞染色體數(shù)目的分布Fig.4 Number frequency of chromosomes at 40th generation in diploid fin cells

圖5 第40 代泥鰍鰭細(xì)胞的生長曲線Fig.5 The growth curve of fin cells at generation 40 of loach

2.6 病毒的敏感性

泥鰍鰭細(xì)胞長滿單層后，接種SVCV 病毒2 d后，細(xì)胞出現(xiàn)病變:細(xì)胞皺縮，變圓，聚集成團(tuán)或解體死亡，單層細(xì)胞中出現(xiàn)空隙，隨著病變的加劇，細(xì)胞空泡化和顆粒化越來越嚴(yán)重;接種4 d后，80%左右的細(xì)胞出現(xiàn)了CPE(圖6 -A)，但對照組正常(圖6 -B)。經(jīng)測定，病毒滴度為105.62TCID50/mL。在盲傳3 代后發(fā)現(xiàn)，泥鰍鰭細(xì)胞對YGNNV 病毒不敏感，細(xì)胞未出現(xiàn)病變。

圖6 泥鰍鰭細(xì)胞感染SVCV 病毒的病變圖Fig.6 Cytopathic effect of fin cells from loach with spring viremia of carp virus(SVCV)

3 討論

3.1 泥鰍鰭細(xì)胞系的建立方法

建立可以連續(xù)傳代細(xì)胞系的前提和關(guān)鍵是能夠成功的啟動(dòng)原代培養(yǎng)。魚類原代培養(yǎng)的方法主要包括絡(luò)合劑分散法、機(jī)械分散法、酶消化法、組織塊固定法［13］。其中，組織塊固定法是將剪好的組織碎塊直接接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中進(jìn)行原代培養(yǎng)，簡便易行，成功率較高［14］。本試驗(yàn)中采用該方法建立了泥鰍鰭細(xì)胞系。

本研究中參考大瀧六線魚鰭、吻端、腎［10］的培養(yǎng)方法，在泥鰍鰭細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用含20%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基，與魏云波［15］建立的褐點(diǎn)石斑魚3種細(xì)胞系和Imajoh等［16］報(bào)道的真鯛細(xì)胞系采用的最適培養(yǎng)基相同。在其他魚類細(xì)胞培養(yǎng)過程中也有采用L-15 培養(yǎng)基的，效果也較好，如Qin等［17］建立的斜帶石斑魚脾臟細(xì)胞系以及樊廷俊等［18］建立的大菱鲆鰭細(xì)胞系。

鰭組織暴露于外界環(huán)境中，所以表面攜帶大量細(xì)菌，而無菌培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。所以原代培養(yǎng)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是對所培養(yǎng)的材料進(jìn)行無菌處理。已有的報(bào)道大多采用酒精漂洗或雙抗溶液浸泡組織［10，15］，但本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用上述消毒方法處理鰭組織不能達(dá)到完全除菌，所以嘗試使用10%的碘伏。碘伏是一種以表面活性劑為載體和增溶的不定型絡(luò)合碘，具有性能穩(wěn)定、使用方便、能緩慢持久釋放有效碘、長效殺菌等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。經(jīng)碘伏和雙抗溶液處理后的組織塊有效降低了原代培養(yǎng)時(shí)的污染，而且細(xì)胞遷出、生長等均未受到影響，效果良好。

3.2 泥鰍鰭細(xì)胞染色體的分析

在不同生物中，染色體的數(shù)目和形態(tài)具有物種特異性，所以其可作為種類鑒定的基本依據(jù)之一。細(xì)胞培養(yǎng)中，染色體數(shù)目是鑒定細(xì)胞系種屬來源以及細(xì)胞系是否發(fā)生變異的重要指標(biāo)［19］。本研究中，對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行染色體滴片，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)出現(xiàn)范圍為43 ～54，出現(xiàn)頻率最高的為50，即該細(xì)胞系特征染色體數(shù)目為50 條。這與李雅娟等［3］報(bào)道的泥鰍染色體數(shù)目一致，證明該細(xì)胞系確實(shí)來自泥鰍組織，并且傳至63 代時(shí)細(xì)胞系尚未發(fā)生染色體變異。

3.3 泥鰍鰭細(xì)胞對病毒的敏感性

利用魚類細(xì)胞系感染擴(kuò)增病毒是魚類病毒學(xué)研究的重要內(nèi)容。許多魚類細(xì)胞系用于水生病毒的分離、鑒定和擴(kuò)增，如鱸鰓細(xì)胞BF-2、石斑魚鰭細(xì)胞GF和石斑魚腎細(xì)胞GK 用于分離YGNNV 病毒、烏鱧呼腸孤病毒(SnRV)和石斑魚虹彩病毒(GIV)［20-21］。本試驗(yàn)中所建立的泥鰍鰭細(xì)胞對SVCV 病毒敏感，而對YGNNV 病毒不敏感，這可能與YGNNV 病毒宿主主要是海水魚類有關(guān)。SVCV 病毒感染泥鰍鰭細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)，所培養(yǎng)的SVCV 病毒可以連續(xù)傳代感染細(xì)胞，病毒滴度為105.62TCID50/mL。說明所建立的泥鰍鰭細(xì)胞系可以用于SVCV 病毒的分離、鑒定和體外繁殖，為今后疫苗的研制等研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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