姚東林，鄒青，劉文斌，謝少林，周愛國(guó)，陳金濤，鄒記興

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510642;2.清遠(yuǎn)市北江水產(chǎn)科學(xué)研究所，廣東 清遠(yuǎn)511510;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇南京210095)

中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)廣泛采用高密度養(yǎng)殖模式，水產(chǎn)品的病害頻繁發(fā)生，長(zhǎng)期使用抗生素等藥物會(huì)導(dǎo)致一些病菌出現(xiàn)耐藥性，而水產(chǎn)品中殘留的藥物還會(huì)危害人類的健康。因此，尋找出一種安全、高效、無(wú)毒的添加劑已成為目前水產(chǎn)飼料添加劑的研究熱點(diǎn)。

地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis是芽孢桿菌Bacillus sp.中最具應(yīng)用前景的一種。地衣芽孢桿菌廣泛存在于自然界中，具有如下優(yōu)點(diǎn):耐熱性好，加工后以孢子形式存在，可在飼料中長(zhǎng)期保存而不影響飼料品質(zhì);生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生多種維生素;能產(chǎn)生多種消化酶，有助于促進(jìn)胃腸道對(duì)飼料的消化吸收;可抑制病原體繁殖，促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)等［1-2］。低聚木糖(xylo -oligosaccharide)是寡糖的一種，可以作為益生元，能促進(jìn)有益菌繁殖，抑制有害菌生長(zhǎng)及減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)，從而提高動(dòng)物的健康水平［3-4］。益生菌和益生元都能促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，由益生菌和益生元組成的微生態(tài)制劑稱為合生素(synbiotics)。有研究表明，合生素可以更好地改善胃腸道的微生物組成，提高生長(zhǎng)速度，兩者的協(xié)同作用效果比單獨(dú)添加效果更好［5］。

本研究中，在草魚Ctenopharyngodon idella 飼料中添加由地衣芽孢桿菌和低聚木糖復(fù)配成的合生素，研究其對(duì)草魚生長(zhǎng)性能、肌肉基本營(yíng)養(yǎng)成分、腸道菌群和消化酶活性的影響，旨在為合生素在魚類飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用草魚初始體質(zhì)量為(71.1 ± 1.4)g，購(gòu)于清遠(yuǎn)市興漁水產(chǎn)科技有限公司。

試驗(yàn)菌種的主要成分為地衣芽孢桿菌(含菌量約為2 ×1010cells/g)，由國(guó)家大宗淡水魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系鯉和團(tuán)頭魴營(yíng)養(yǎng)崗位提供。低聚木糖產(chǎn)品(含量為35%)由江蘇康維生物有限公司提供。將地衣芽孢桿菌菌種和低聚木糖產(chǎn)品按1∶ 1(質(zhì)量比)配制成合生素，以便于試驗(yàn)中使用。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 挑選生長(zhǎng)良好、大小均勻的草魚300 尾，隨機(jī)放入6 個(gè)大小為2 m×2 m×1.5 m的網(wǎng)箱里，每個(gè)網(wǎng)箱放入草魚50 尾。將6 個(gè)網(wǎng)箱分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)平行。

1.2.2 試驗(yàn)飼料及養(yǎng)殖管理 對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組投喂在基礎(chǔ)飼料中添加0.1%合生素(0.05%地衣芽孢桿菌和0.05%低聚木糖)的飼料。每天10:00和16:00 分別投喂1次，日投喂量為魚體質(zhì)量的3.5%，飼喂量每隔15 d 根據(jù)魚體質(zhì)量調(diào)整一次，養(yǎng)殖試驗(yàn)共進(jìn)行92 d。

養(yǎng)殖期間，水體溶氧為5.5 mg/L 以上，水溫為24 ～33 ℃，pH 為6.9 ～7.2。基礎(chǔ)飼料配方(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))為:豆粕23%，棉粕20%，菜粕23%，小麥10%，小麥麩10%，DDGS 5%，精煉魚油0.5%，豆油0.5%，沸石粉1.96%，磷酸二氫鈣1%，維生素預(yù)混料2%，乙氧基喹啉0.02%，丙酸鈣0.02%，海藻酸鈉2%。其中每千克維生素預(yù)混料包含:VA 75 ×104IU，VD315 ×104IU，VE 14 g，VK3325 mg，VB11500 mg，VB21250 mg，VB61100 mg，VB124 mg，VC 2.5 g，肌酸5.5 g，煙酸4 g，泛酸4.5 g，葉酸70 mg，生物素125 mg，膽堿150 g，鎂45 g，鐵15 g，銅0.35 g，鋅3 g，錳1.5 g，碘50 mg，硒9 mg，鈷11 mg，磷105 g，鈣330 g。試驗(yàn)飼料營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 草魚飼料的營(yíng)養(yǎng)組成Tab.1 The approximate composition of the basic diets for grass carp w/%

1.2.3 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，停止喂食一天，統(tǒng)計(jì)草魚數(shù)量，計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組草魚的增重率、飼料系數(shù)和存活率，其計(jì)算公式為

1.2.4 基本營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 取試驗(yàn)組和對(duì)照組魚的肌肉和飼料，分別采用烘箱干燥法和真空冷凍干燥法測(cè)定飼料和肌肉中的水分含量，分別用凱氏定氮儀、索氏提取法、馬福爐灼燒(550 ℃)法測(cè)定肌肉或飼料中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量。

1.2.5 消化酶活性的測(cè)定 分別從試驗(yàn)組和對(duì)照組取10 尾魚于冰盤上解剖，取腸道(去除內(nèi)容物)和肝胰臟，剔除脂肪組織并沖洗干凈，按照質(zhì)量與體積比為1∶ 9(g∶ mL)加入生理鹽水，在0 ℃冰浴下勻漿，取勻漿液于4 ℃下以4000 r/min離心10 min，取上清液于冰箱中(4 ℃)保存，24 h 內(nèi)待測(cè)。

草魚腸道、肝胰臟中的消化酶指標(biāo)包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，采用Folin -酚法測(cè)定蛋白酶，分別采用南京建成生物工程研究所的脂肪酶試劑盒和淀粉酶試劑盒測(cè)定脂肪酶和淀粉酶。

1.2.6 腸道特定微生物數(shù)量的測(cè)定 分別取試驗(yàn)組和對(duì)照組各10 尾魚的腸道內(nèi)容物于冰盤上，用無(wú)菌生理鹽水將腸道內(nèi)容物分別稀釋10、102、103、104、105、106倍。選取其中3 個(gè)稀釋倍數(shù)，用移液槍取100 μL 溶液涂布于相對(duì)應(yīng)的篩選培養(yǎng)基上。每克腸道內(nèi)容物中的菌落數(shù)(CFU)=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10，其中微生物數(shù)量單位用lg CFU/g表示。本試驗(yàn)中篩選用培養(yǎng)基及其對(duì)應(yīng)微生物種類、培養(yǎng)條件和稀釋倍數(shù)如表2所示。

表2 草魚腸道中特定細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和稀釋倍數(shù)Tab.2 The selective medium，culture conditions and dilution ratio for intestinal microflora in grass carp

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ±S.E.)表示(置信區(qū)間為0.05)。采用SPSS 19.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 草魚的生長(zhǎng)性能

從表3可見:試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組草魚的平均增重率比對(duì)照組顯著提高了20.9%(P＜0.05);試驗(yàn)組草魚的餌料系數(shù)比對(duì)照組顯著降低了8.9%(P＜0.05);試驗(yàn)組草魚的存活率比對(duì)照組略有提高，但無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。

表3 飼料中添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖組成的合生素對(duì)草魚生長(zhǎng)性能的影響Tab.3 Effects of dietary synbiotics comprised of Bacillus licheniformis and xylo－oligosaccharide on weight gain rate and food conversion ratio in grass carp

2.2 肌肉營(yíng)養(yǎng)成分

從表4可見:試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組草魚肌肉中的水分、粗蛋白質(zhì)、粗灰分和粗脂肪含量與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。

表4 飼料中添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖組成的合生素對(duì)草魚肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響Tab.4 Effects of dietary synbiotics comprised of Bacillus licheniformis and xylo－oligosaccharide on muscle nutrition in grass carp w/%

2.3 腸道微生物菌群數(shù)量

從表5可見:試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組草魚中的大腸桿菌數(shù)量比對(duì)照組顯著減少了9.4%(P＜0.05);而芽孢桿菌和乳酸桿菌數(shù)量則比對(duì)照組分別顯著增加了21.6%和7.7%(P＜0.05)。

表5 飼料中添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖組成的合生素對(duì)草魚消化道微生物菌群數(shù)量的影響Tab.5 Effects of dietary synbiotics comprised of Bacillus licheniformis and xylo－oligosaccharide on intestinal microflora in grass carp lg CFU/g

2.4 腸道和肝胰臟中消化酶的活性

從表6可見:試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組草魚腸道中，胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分別比對(duì)照組顯著提高了18.8%、36.8%、19.8%(P＜0.05);而肝胰臟中，胰蛋白酶和脂肪酶的活性分別比對(duì)照組顯著提高了14.6%和21.7%(P＜0.05)，淀粉酶活性比對(duì)照組略有升高，但無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。

表6 飼料中添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖組成的合生素對(duì)草魚消化酶活性的影響Tab.6 Effects of dietary synbiotics comprised of Bacillus licheniformis and xylo－oligosaccharide on digestive enzyme activities in grass carp

3 討論

3.1 飼料中添加合生素對(duì)草魚生長(zhǎng)性能的影響

研究顯示，芽孢桿菌能顯著提高動(dòng)物腸道黏膜厚度，增加腸道絨毛的高度和細(xì)胞密度，并能產(chǎn)生多種消化酶類，有助于改善腸道健康，提高魚類的生長(zhǎng)速度［6-8］，同時(shí)，芽孢桿菌還可以顯著提高草魚的增重率和特定生長(zhǎng)率［7，9］。

在飼料中添加寡糖有利于提高魚類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)，從而起到促進(jìn)魚類生長(zhǎng)的作用［10-11］。孫立威等［12］研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖能顯著提高羅非魚幼魚的生長(zhǎng)性能，并能顯著提高其抗病能力。

有研究表明，益生菌和寡糖搭配使用，比起單獨(dú)使用益生菌可以更好地提高魚類的生長(zhǎng)性能［13］;劉波等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在異育銀鯽飼料中搭配添加芽孢桿菌和低聚木糖能顯著提高其生長(zhǎng)性能，且效果比單獨(dú)添加芽孢桿菌要好。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加0.1%由地衣芽孢桿菌和低聚木糖制成的合生素可以顯著提高草魚的生長(zhǎng)性能，試驗(yàn)組魚的平均增重率比對(duì)照組顯著提高了20.9%，餌料系數(shù)比對(duì)照組降低了8.9%，說(shuō)明添加合生素對(duì)草魚的消化吸收功能是有明顯的提高作用，也證明了飼料中添加由芽孢桿菌和寡糖組成的合生素可以有效提高草魚的生長(zhǎng)性能。

3.2 飼料中添加合生素對(duì)草魚肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

鐘國(guó)防等［15］研究認(rèn)為，在飼養(yǎng)環(huán)境十分相近的條件下，同一種魚類的肌肉營(yíng)養(yǎng)成分是比較穩(wěn)定的，一般不會(huì)因?yàn)樵陲暳现屑尤肷倭康奶砑觿┒l(fā)生顯著改變。邱燕等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加芽孢桿菌對(duì)草魚全魚和肌肉的水分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量均沒有明顯影響。曹丹等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在異育銀鯽的飼料中添加殼聚糖，可以顯著提高其生長(zhǎng)性能，但是對(duì)異育銀鯽的肌肉營(yíng)養(yǎng)成分沒有顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在草魚飼料中添加0.1%由地衣芽孢桿菌和低聚木糖組成的合生素后，試驗(yàn)組草魚肌肉中水分、粗蛋白質(zhì)、粗灰分和粗脂肪含量均與對(duì)照組沒有明顯改變，說(shuō)明在飼料中添加一定量的由地衣芽孢桿菌和低聚木糖配制的合生素不足以影響草魚的肌肉營(yíng)養(yǎng)成分，此結(jié)果與上述研究者的結(jié)論一致。

3.3 飼料中添加合生素對(duì)草魚腸道菌群的影響

魚類的腸道微生物群落是由多種微生物組成的一個(gè)處于動(dòng)態(tài)平衡的整體，不同微生物之間以及微生物與宿主之間存在著十分密切的聯(lián)系，對(duì)宿主的消化吸收、健康狀況有重要的影響。研究表明，在飼料中添加芽孢桿菌可以改變魚類腸道微生物的組成比例，提高益生菌數(shù)量，減少大腸桿菌的數(shù)量［8，18-20］。

劉波等［14］研究表明，在異育銀鯽飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的地衣芽孢桿菌，可以顯著減少異育銀鯽大腸桿菌數(shù)量，提高芽孢桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。劉文斌等［13］研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌與低聚木糖配伍添加在異育銀鯽飼料中，異育銀鯽腸道微生物益生菌數(shù)量明顯多于各自單獨(dú)添加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在草魚飼料中添加0.1%由地衣芽孢桿菌和低聚木糖組成的合生素后，能使試驗(yàn)組草魚腸道內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量比對(duì)照組顯著減少，而芽孢桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量顯著提高，說(shuō)明由地衣芽孢桿菌和低聚木糖配制的合生素可以顯著改善草魚腸道的菌群結(jié)構(gòu)。

3.4 飼料中添加合生素對(duì)草魚腸道和肝胰臟消化酶活性的影響

Ghosh等［8］研究表明，魚類胃腸道中益生菌可以分泌多種消化酶，如蛋白酶、纖維素酶、果膠酶和植酸酶等，其中有些酶是動(dòng)物腸道本身無(wú)法合成的，需要依靠腸道內(nèi)的細(xì)菌來(lái)提供。

研究表明，在飼料中添加益生菌可以提高魚類消化酶的活性［2，11］。曲藝等［21］在草魚飼料中添加芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其腸道消化酶活性有顯著提高。李衛(wèi)芬等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加芽孢桿菌，可以使草魚肝胰臟和腸道內(nèi)容物中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性分別比對(duì)照組有顯著提高。蔡立勝等［10］研究表明，在飼料中添加寡糖類物質(zhì)能顯著提高鮸消化酶活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在草魚飼料中添加0.1%由地衣芽孢桿菌和低聚木糖組成的合生素，能使試驗(yàn)組草魚的腸道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性比對(duì)照組有顯著提高，此結(jié)果與上述研究者的結(jié)論一致。在本試驗(yàn)草魚的肝胰臟消化酶指標(biāo)中，試驗(yàn)組魚胰蛋白酶和脂肪酶的活性比對(duì)照組有顯著提高，但是提高程度比胃腸道消化酶提高的程度低;而淀粉酶活性與對(duì)照組沒有顯著性差異，可能是地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)肝胰臟消化酶的影響不如其對(duì)腸道消化酶活性的影響大，但仍然有一定的效果。

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