何旭穎，王冰，張賽賽，沈雙燁，謝喚，王偉

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

太平洋鱈Gadus macrocephalus Tilesius 俗名大頭鱈，隸屬于硬骨魚綱Osteichthves、鱈形目Gadiformes、鱈科Gadidae、鱈屬Gadus，是典型的冷水性魚類，分布于太平洋北部沿岸海域，多棲息于大陸架和大陸斜坡上部水深10 ～550 m 的海域中。中國的太平洋鱈主要產(chǎn)于黃海，一般棲息于水深為50 ～80 m 的泥沙或軟泥底質(zhì)海區(qū)［1］。太平洋鱈是經(jīng)濟價值較高的魚類之一，其肉質(zhì)白細鮮嫩、清口不膩，呈蒜瓣狀，是鱈科魚類中的主要捕撈對象［1］。目前，國外已經(jīng)形成了一套完整的大西洋鱈人工繁殖和養(yǎng)殖模式，太平洋鱈已成為北歐、北美等諸多國家新的重要養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加［2-3］。太平洋鱈的人工育苗技術(shù)雖然在國外已經(jīng)獲得成功，但在中國尚未獲得突破。國內(nèi)對太平洋鱈的系統(tǒng)研究甚少［1，4-6］，僅有少量關(guān)于其生物學(xué)的初步研究［7］。

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)屬于溴系阻燃劑的一種，被廣泛應(yīng)用于電子、電器、化工等領(lǐng)域中［8］。PBDEs 具有一定的揮發(fā)性，可隨大氣長距離遷移，且親脂性強、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可隨食物鏈生物富集和放大，是一種持久性有機污染物［9］。十溴聯(lián)苯醚(BDE -209)是國內(nèi)產(chǎn)量最大、最具代表性的高分子含溴阻燃劑［10-12］。目前，PBDEs 對海洋環(huán)境的影響已成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的熱點問題之一。中國對PBDEs 的研究起步較晚，對PBDEs在環(huán)境中遷移轉(zhuǎn)化的研究雖取得了一些成果，但對PBDEs 的生物毒理研究才剛剛起步。

國內(nèi)關(guān)于環(huán)境持久性有機污染物對魚類毒性的研究主要集中在其對生物體本身的毒性作用以及對生物體遺傳毒性方面，而有關(guān)其對魚類精子影響方面的研究尚屬空白。生物的精子活力、精子運動能力對受精率具有重要的影響［13-14］。而對于體外受精種類而言，研究持久性有機污染物對其精子形態(tài)、存活率等的影響，顯得尤為重要。目前，對于PBDEs 毒性研究的相關(guān)試驗大多是單一的針對PBDEs在短周期、高劑量暴露下的生物效應(yīng)的研究，而根據(jù)環(huán)境中存在的多溴聯(lián)苯醚濃度設(shè)置試驗濃度的相關(guān)研究卻鮮有報道［15］。本試驗中，根據(jù)環(huán)境中多溴聯(lián)苯醚的含量進行不同試驗濃度的設(shè)置，采用掃描電鏡和透射電鏡觀察太平洋鱈精子的超微結(jié)構(gòu)，研究不同濃度的十溴聯(lián)苯醚對其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，旨在豐富太平洋鱈的相關(guān)生物學(xué)研究內(nèi)容，為海水中十溴聯(lián)苯醚安全含量的監(jiān)測以及探究十溴聯(lián)苯醚的毒性機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗試劑 十溴聯(lián)苯醚購自百靈威試劑公司，二甲基亞砜(DMSO)購自上海生工有限公司，其余試劑均購自沈聯(lián)試劑公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 精液來源 雄性太平洋鱈購自大連市黑石礁市場，2 ～4 齡，體長為30 ～60 cm。選擇體質(zhì)健壯、無傷病的太平洋鱈作為試驗對象，試驗前暫養(yǎng)于大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室。取樣時先用蒸餾水沖洗太平洋鱈泄殖腔，再用干毛巾將泄殖腔周圍擦干，輕壓腹部，收集精子。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗分為7 組，即對照組、DMSO 對照組和5 個十溴聯(lián)苯醚試驗組，每組設(shè)3個平行，各組試劑濃度見表1。對照組采用自然海水。取適量太平洋鱈精子放于100 mL 燒杯中(鏡檢精子密度為105個/mL，存活率＞90%)，進行暴露，并分別在暴露后2、4、8、12 h 時取樣，每次取1 mL 精液，以2000 r/min 離心10 min，去除上清液，然后沿管壁小心加入等體積2.5%(體積分數(shù))的戊二醛固定，于冰箱(4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗各組十溴聯(lián)苯醚和DMSO 暴露濃度的設(shè)置Tab.1 The concentrations of decabromodiphenyl ethers and DMSO in the experiment

1.2.2 掃描電鏡(SEM)樣品的制備 用0.1 mol/L PBS 洗滌精子3次，每次浸洗10 ～15 min，用梯度叔丁醇脫水處理，分兩個階段進行，第一階段的叔丁醇分別為50%、70%、80%、90%、95%(體積分數(shù))，各級脫水處理10 min;第二階段用純叔丁醇脫水3次，每次10 min。將經(jīng)脫水處理后的精子連帶叔丁醇置于冰箱(4 ℃)中，待叔丁醇變?yōu)楣虘B(tài)時，再將其轉(zhuǎn)至真空抽濾瓶中進行真空干燥。將干燥的精子粘貼于有導(dǎo)電膠的金屬樣品臺上，用離子噴涂儀在精子樣品表面均勻鍍一層能夠?qū)щ姷慕鹉?，并置于掃描電鏡下觀察并拍照。

1.2.3 透射電鏡(TEM)樣品的制備 用體積分數(shù)為1%的鋨酸雙重固定，用梯度乙醇脫水、樹脂包埋、AO 超薄切片機切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，在JEOL 1200EX 電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 太平洋鱈正常精子的形態(tài)

在電子顯微鏡下觀察，對照組、DMSO 對照組、0.5 ng/L 濃度組、5 ng/L 濃度組、50 ng/L 濃度組和500 ng/L 濃度組的太平洋鱈精子超微結(jié)構(gòu)大部分形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)基本完整(圖1)。在掃描電鏡下觀察，正常精子細胞表面比較均勻、光滑，主要由頭部、中段和尾部3 部分組成(圖1 -A、B);在透射電鏡下觀察，精子質(zhì)膜完整，細胞核連續(xù)，核染色質(zhì)致密而均勻。

在掃描電鏡下觀察，精子頭部呈卵圓形，長徑為(2.334 ± 0.044)μm，短徑為(1.422 ±0.285)μm，主要結(jié)構(gòu)是細胞核(圖1 -C)。在透射電鏡下觀察，細胞核染色質(zhì)致密，由核膜包被，核前方無頂體，核后方有一植入窩，植入窩較深，為細胞核的1/2 ～3/4(圖1 -I)。

在透射電鏡下觀察，精子中段由中心粒復(fù)合體和袖套組成(圖1 -H)。中心粒復(fù)合體位于植入窩內(nèi)，包括近端中心粒和遠端中心粒(基體)，近端中心粒位于植入窩的前端，由9 組三聯(lián)微管組成，基體位于植入窩后端，與近端中心粒呈“T”字形(圖1-I、J)。袖套呈筒狀，中央的腔即為袖套腔，袖套腔較狹窄(圖1 -E、I)。袖套中包括4 ～6 個線粒體，呈不規(guī)則排列，線粒體的雙膜層和內(nèi)嵴均清晰可見，基質(zhì)較疏松(圖1 -K、G)。

在透射電鏡下觀察，由基體發(fā)出的軸絲向后延伸并連同少量的細胞質(zhì)構(gòu)成精子的鞭毛，此為精子的尾部。鞭毛長度為(28.078 ±3.573)μm，直徑為(0.206 ±0.250)μm，鞭毛橫切面略呈圓形，外由一層膜包圍，內(nèi)由軸絲和微管系統(tǒng)組成，微管結(jié)構(gòu)為典型的“9+2”雙聯(lián)微管結(jié)構(gòu)(圖1 -F)。尾部外表面有由質(zhì)膜向兩側(cè)突出而形成的側(cè)鰭(圖1 -D)。

圖1 太平洋鱈正常精子的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of nomal spermtozoa in Pacific cod Gadus macrocephalus Tilesius

2.2 太平洋鱈異常精子的形態(tài)

暴露于高濃度十溴聯(lián)苯醚(5000 ng/L)的太平洋鱈精子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一些不同程度的異常，主要體現(xiàn)在精子質(zhì)膜、細胞核、線粒體和鞭毛的變化上，其中暴露2 h 時試驗組的精子形態(tài)基本完整，4、8、12 h 時試驗組精子的形態(tài)發(fā)生不同程度的改變(圖2)。

在掃描電鏡下觀察，暴露于高濃度十溴聯(lián)苯醚(5000 ng/L)2 h和4 h 時的精子形態(tài)基本完整，與對照組相比無顯著變化;8 h 時精子細胞核表面出現(xiàn)白色結(jié)晶狀病變(圖2 -A);12 h 時精子細胞核破裂、變形，線粒體減少，可見鞭毛斷裂痕跡(圖2 -B)。在透射電鏡下觀察，暴露2 h 時大多數(shù)精子形態(tài)與對照組相比無顯著變化;4 h 時偶有質(zhì)膜膨脹表現(xiàn)，線粒體移位，其他結(jié)構(gòu)均完整(圖2 -C);8 h 時出現(xiàn)精子質(zhì)膜破裂，線粒體部分膜結(jié)構(gòu)受損，內(nèi)嵴斷裂，甚至溶解，基質(zhì)變淺，呈空泡樣(圖2 -D、E)，鞭毛偶有斷裂;12 h 時大多數(shù)精子質(zhì)膜消失，鞭毛大量脫落、堆積(圖2 -F)，部分微管結(jié)構(gòu)解體，甚至消失(圖2 - H)，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)基本消失(圖2 -G)。

圖2 高濃度組(5000 ng/L)太平洋鱈異常精子的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of spermtozoa of Pacific cod Gadus macrocephalus exposed to 5000 ng/L decabromodiphenyl

3 討論

3.1 太平洋鱈精子超微結(jié)構(gòu)的變化與功能的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度(5000 ng/L)十溴聯(lián)苯醚對太平洋鱈的質(zhì)膜、細胞核、線粒體和鞭毛均有不同程度的損傷作用。暴露4 h 時，高濃度組精子開始出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，隨著時間的延長，變化更為明顯，如細胞質(zhì)膜破裂，甚至消失，細胞核變形，線粒體空泡狀等。

精子細胞膜的組成與一般細胞膜相似，由糖蛋白和磷脂組成，其中磷脂是精子細胞膜的穩(wěn)定劑，磷脂的改變，對精子的代謝、獲能、受精，以及藥物毒性的滲入有重要意義［16-17］。本試驗中，高濃度(5000 ng/L)十溴聯(lián)苯醚即可損壞精子的細胞膜，破壞膜的完整性和穩(wěn)定性，使毒物進入細胞內(nèi)，從而破壞精子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，抑制精子的活動能力，甚至殺死精子，影響受精率。

線粒體是氧化磷酸化的主要部位，其中含有脫氫酶和三磷酸腺苷酶(ATP)［18］。精子運動的能量主要來自于線粒體，可見線粒體的完整性對于精子的活力至關(guān)重要。高濃度十溴聯(lián)苯醚可使精子中段線粒體變形，嵴溶解，呈空泡樣，從而使ATP 酶的產(chǎn)生受阻，能源枯竭，進而嚴重影響精子的活力。本試驗結(jié)果證明，有機污染物對精子活力影響的一個重要方面是來自于對線粒體的損害，影響供能，進而影響精子活力，這是研究持久性有機污染物對精子影響的一個重要突破。

鞭毛為精子的主要運動器官，精子尾部的擺動能使精子運動，而與尾部運動直接相關(guān)的是中央軸絲，即中央2 對和外周9 對微管結(jié)構(gòu)。尾部的擺動是由每對二聯(lián)微管之間的相對滑動引起的，二聯(lián)微管上的纖毛蛋白臂中含有大量的ATP 酶，可以水解ATP 以供給能量［18］。本試驗中，暴露于高濃度(5000 ng/L)十溴聯(lián)苯醚中8 h和12 h 時，太平洋鱈精子均出現(xiàn)鞭毛異?，F(xiàn)象，12 h 時鞭毛大量脫落，軸絲微管結(jié)構(gòu)解體，甚至消失，從而使精子失去了運動能力。而12 h 時精子的線粒體也基本萎縮，內(nèi)嵴消失，失去了供能的能力。由此可認為，太平洋鱈精子在濃度為5000 ng/L 的十溴聯(lián)苯醚中暴露12 h 時基本可以被完全殺死。

通過本試驗結(jié)果可以推出十溴聯(lián)苯醚對太平洋鱈精子的主要影響:(1)破壞精子質(zhì)膜;(2)破壞線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu);(3)破壞精子的鞭毛，損傷軸絲微管系統(tǒng)。

3.2 十溴聯(lián)苯醚的毒性及生態(tài)風(fēng)險評價

多溴聯(lián)苯醚是一類重要的溴代阻燃劑，含量從5%到30% 不等［19］，其中十溴聯(lián)苯醚(PBDE -209)是中國國內(nèi)產(chǎn)量最大的含溴阻燃劑［10-12］。目前，六溴聯(lián)苯醚、七溴聯(lián)苯醚、四溴聯(lián)苯醚、五溴聯(lián)苯醚已被列入禁用名單，其中四溴聯(lián)苯醚的毒性最大。雖然十溴聯(lián)苯醚毒性不如四溴聯(lián)苯醚劇烈，但隨著近些年來電子電器產(chǎn)業(yè)突飛猛進，十溴聯(lián)苯醚作為高效的含溴阻燃劑在國內(nèi)大量生產(chǎn)使用，電子廢棄物等的大量排放造成環(huán)境污染日趨嚴重，因此，其在環(huán)境中的毒性累積作用也不容忽視。

研究表明，海洋、河口地區(qū)水中PBDE -209的質(zhì)量濃度范圍一般在0.05 ～65.20 ng/L［20-23］。本試驗中根據(jù)此濃度范圍設(shè)置5 個濃度，即0.5、5、50、500、5000 ng/L。試驗結(jié)果表明，濃度為0.5、5、50、500 ng/L 的十溴聯(lián)苯醚對太平洋鱈精子超微結(jié)構(gòu)無顯著性影響，而濃度為5000 ng/L 十溴聯(lián)苯醚對太平洋鱈精子超微結(jié)構(gòu)影響顯著。由此可得出，當(dāng)海洋中十溴聯(lián)苯醚含量達到5000 ng/L 時，即可以殺死大部分精子，影響海洋生物的受精，進而引起海洋中生物的減少，極有可能導(dǎo)致該物種的消亡。盡管目前環(huán)境中的十溴聯(lián)苯醚濃度達不到5000 ng/L，但是在現(xiàn)實環(huán)境中，不僅只有一種污染物獨立存在，而是幾種污染物同時存在，同時起作用［22］，眾多的污染物勢必會在達到某一個界限時引發(fā)精子的致畸和死亡。另一方面，人和動物暴露于PBDEs 的主要途徑是通過食物鏈的傳遞作用［24-25］。PBDEs 屬于非離子型化合物，其持久性強、水溶性低，與顆粒物具有很強的親和性，易在沉積物和生物體內(nèi)累積［26-27］。因此，PBDEs 的累積作用也不容忽視，PBDEs在生物體內(nèi)長久累積，當(dāng)其達到一定的濃度值時，勢必會引起對生物體的毒性作用，對于此方面的深入研究應(yīng)給予足夠的重視。而本試驗中所研究的十溴聯(lián)苯醚，也可與其他多溴聯(lián)苯醚同系物之間，包括與其他污染物(如多氯聯(lián)苯、多氯化萘等)之間形成多種環(huán)境污染物，其是否具有協(xié)同效應(yīng)，目前還沒有確切的報道。因此，上述環(huán)境持久性有機污染物的聯(lián)合作用方式、作用部位，以及劑量-效應(yīng)之間的關(guān)系等還有待進一步研究。

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