王吉祥，張學(xué)忠，王亞琴，牛之瑞，馮 雷，趙 昱

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650223）

聯(lián)苯菊酯，別名氟氯菊酯，是擬除蟲(chóng)菊酯的一種，由于其殺蟲(chóng)譜廣、效果好、殘留低、無(wú)蓄積作用等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在茶葉病蟲(chóng)害應(yīng)用非常廣泛。茶葉成分復(fù)雜，較蔬菜、水果中的農(nóng)藥殘留分析難度大。筆者在長(zhǎng)期檢測(cè)茶葉中農(nóng)藥殘留時(shí)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)苯菊酯的陽(yáng)性率較高，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果在限量附近時(shí)，實(shí)驗(yàn)室出具的檢測(cè)結(jié)果直接關(guān)系到茶葉是否合格的判定，為了確保檢測(cè)結(jié)果的可信度，必須進(jìn)行測(cè)量不確定度的評(píng)定。測(cè)量不確定度分析評(píng)定是日常檢測(cè)工作中的重要技術(shù)組成部分，對(duì)于質(zhì)量控制也具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)JJF 1059—1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》中有關(guān)規(guī)定[1-3]，對(duì)氣相色譜（gas chromatography，GC）法和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法兩種方法的測(cè)量不確定度進(jìn)行比較與分析，找到檢測(cè)過(guò)程中各項(xiàng)不確定度來(lái)源對(duì)測(cè)量結(jié)果不確定度的影響程度，從而找到提高檢測(cè)質(zhì)量的方向。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

聯(lián)苯菊酯（針劑型，質(zhì)量濃度100 μg/mL） 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；ENVI-Carb固相萃取小柱（3 mL）、LC-Florisil固相萃取小柱（6 mL） 美國(guó)Supelco公司；Cleanert TPT固相萃取小柱（10 mL） 美國(guó)Agela公司；丙酮、乙腈、正己烷（均為色譜純） 美國(guó)Fisher Scientific公司。

7890A氣相色譜儀（配有電子捕獲檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；QP 2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜儀（配電子電離源） 日本Shimadzu公司；GL-12B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；N-EVAP氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；CPA225D電子天平 德國(guó)Sartorius公司；十二孔固相萃取裝置 美國(guó)Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的提取與凈化[4-5]

1.2.1.1 GC-MS法

準(zhǔn)確稱取制好的茶葉粉末5.0 g，加入20.0 mL乙腈，超聲30 min，5 000 r/min離心10 min，吸取2 mL上清液，待凈化。

在Cleanert TPT凈化柱中加入2 cm高的無(wú)水硫酸鈉，用10 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）淋洗凈化萃取柱，棄去淋出液。當(dāng)淋洗液液面到達(dá)無(wú)水硫酸鈉層頂面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用15 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）洗滌小柱，收集洗脫液，低溫氮吹至凈干，用正己烷定容至0.5 mL，待測(cè)。

1.2.1.2 GC法

準(zhǔn)確稱取制好的茶葉粉末5.0 g，加入20.0 mL乙腈，超聲30 min，5 000 r/min離心10 min，吸取2 mL上清液，低溫氮吹至凈干，用2.0 mL正己烷-丙酮（2∶1，V/V）溶解，待凈化。

將ENVI-Carb小柱用2.0 mL正己烷-丙酮（2∶1，V/V）預(yù)淋洗，條件化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用10 mL比色管接收洗脫液約8 mL，低溫氮吹至約1 mL，用正己烷-丙酮（9∶1，V/V）2 mL溶解，待下一步凈化。然后將Florisil小柱用2.0 mL正己烷-丙酮（9∶1，V/V）預(yù)淋洗，條件化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用10 mL比色管接收洗脫液約8 mL，低溫氮吹至凈干，用正己烷定容至0.5 mL，待測(cè)。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 GC-MS條件

色譜柱：DB-5MS（0.25 mm×30 m，0.25μm）石英毛細(xì)管柱；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；柱溫：初始溫度82 ℃，保持5 min，然后以8 ℃/min程序升溫到280 ℃，保持15 min；柱流速：1.75 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，1 min后開(kāi)閥。

離子源：電子電離源；離子源溫度：230 ℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度：280 ℃；溶劑延遲時(shí)間：3.5 min；全掃描范圍m/z50～450用于測(cè)定樣品凈化效果，選擇離子監(jiān)測(cè)用于定性和定量測(cè)定。

1.2.2.2 GC法條件

色譜柱：HP-5（0.18 mm×20 m，0.18 μm）石英毛細(xì)管柱；載氣：氮?dú)猓兌取?9.999%）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測(cè)器溫度：300 ℃；柱溫：初始溫度125 ℃，保持1 min，然后以25 ℃/min程序升溫到200 ℃，再以8 ℃/min程序升溫到232 ℃，保持4 min， 再以10 ℃/min程序升溫到292 ℃，保持1 min；柱流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，1 min后開(kāi)閥。

1.2.3 數(shù)學(xué)模型的建立

用外標(biāo)法計(jì)算茶葉中聯(lián)苯菊酯的含量，其數(shù)學(xué)模型[4-5]：

式中：X為樣品測(cè)定含量/（mg/kg）；Cs為標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為樣品提取溶劑總體積/mL；V2為提取體積/mL；V3為待測(cè)液定容體積/mL；A為樣品液?jiǎn)挝贿M(jìn)樣量峰面積；As為標(biāo)準(zhǔn)工作液?jiǎn)挝贿M(jìn)樣量峰面積；m為樣品稱樣量/g；frec為回收率校正因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 校準(zhǔn)過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

這一過(guò)程產(chǎn)生的不確定度屬B類不確定度，查標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的證書，聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，質(zhì)量濃度為（100.0±0.06）μg/mL，s為證書給出的定量值，其相對(duì)不確定度是：

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度（按B類不確定度評(píng)價(jià)）[6]

由于標(biāo)準(zhǔn)品使用的是配制好的針劑型標(biāo)準(zhǔn)溶液，因此不需要考慮標(biāo)注溶液配制過(guò)程中稱量帶來(lái)的不確定不分量，只要考慮定容帶來(lái)的分量。

7 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程產(chǎn)生的不確定度。使用l mL移液管吸取0.7 mL 100 μg/mL聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，移至10 mL 容量瓶（A級(jí)）中，用正己烷定容至刻度。10 mL 容量瓶（A級(jí)）的體積允許差為±0.02 mL，按照矩形分布計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)不確定度是1 mL 移液管的容量允許差為±0.008 mL，按照矩形分布計(jì)算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：

配制聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥7 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)程的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：

按以上過(guò)程配制0.014、0.035、0.070、0.140、0.280 μg/mL聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算時(shí)取最大的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度值，即按Urel（VS）=0.004 8。

溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度大多都在15～25 ℃之間，與20 ℃相差不超過(guò)5 ℃，因溫度變化引起容量瓶的最大體積變化為：Vtemp=10 mL×5 ℃×1.36×10－3℃－1=0.068 mL。式中：1.36×10－3℃－1為正己烷的熱膨脹系數(shù)。按照矩形分布計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：

因此，由聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的不確定度為：

2.1.3 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品質(zhì)量濃度時(shí)產(chǎn)生的不確定度[7-20]

采用5 個(gè)水平的聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用GC和GC-MS測(cè)定3 次，得到相應(yīng)的峰面積，用最小二乘法進(jìn)行擬合，得到擬合方程y=aC+b，以及相關(guān)系數(shù)r。

表1 線性回歸方程擬合過(guò)程及結(jié)果Table 1 Linear regression equation fitting and results

表2 樣品中聯(lián)苯菊酯殘留量平行測(cè)量結(jié)果Table 2 Parallel measurements of bifenthrin residues in samples

標(biāo)準(zhǔn)曲線求質(zhì)量濃度時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由式（5）計(jì)算：

其中：

式中：a為工作曲線的斜率；p為樣品平行測(cè)定的次數(shù)；m為標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定的次數(shù)；n為所配標(biāo)準(zhǔn)溶液個(gè)數(shù)；Sc/c為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度殘差的平方和；Sy/c為工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Yij為各質(zhì)量濃度點(diǎn)測(cè)定響應(yīng)值；Yi為線性方程計(jì)算響應(yīng)值；C0為樣品中聯(lián)苯菊酯殘留量的平均質(zhì)量濃度；為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度。

相對(duì)不確定度：

表3 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)引入不確定度計(jì)算結(jié)果Table 3 Uncertainty calculations from standard curve fitting by least squares regression analysis

校準(zhǔn)過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 樣品前處理過(guò)程產(chǎn)生的不確定度

2.2.1 樣品稱量引入的不確定度

天平校準(zhǔn)允許的最大誤差為±0.000 1g，稱取茶葉5 g，取矩形分布，引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品定容引入的不確定度

凈化完畢后，經(jīng)氮?dú)獯蹈傻臉悠愤M(jìn)行定容，使用1 mL（V3）移液管，其允許的最大誤差為0.008 mL，取矩形分布，引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.3 樣品提取與凈化引入的不確定度

樣品的提取與凈化包含很多步驟，每一步驟都會(huì)引入不確定度，逐步確定每一步驟對(duì)測(cè)量結(jié)果不確定度的貢獻(xiàn)是相對(duì)困難的。實(shí)驗(yàn)中采用方法的回收率對(duì)前處理過(guò)程中引入的不確定度進(jìn)行評(píng)定。在陰性樣品中加入聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，使其含量為0.056 mg/L，進(jìn)行回收率（R）實(shí)驗(yàn)每個(gè)5 次重復(fù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)Table 4 Results of replicate recovery tests

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

為了確定回收率是否計(jì)入聯(lián)苯菊酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算中，應(yīng)對(duì)平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)：

當(dāng)t大于雙邊臨界值t（95,2）=4.3時(shí)，則回收率R有顯著性差異，回收率應(yīng)用以修正結(jié)果；相反，則不必使用。

表5 茶葉中聯(lián)苯菊酯 顯著性檢驗(yàn)Table 5 significance test for bifenthrin residues in tea

上述各因素互不相關(guān)，因此，樣品的前處理過(guò)程的不確定度為：

2.3 檢測(cè)過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度

隨機(jī)效應(yīng)通常產(chǎn)生于影響量的不可預(yù)測(cè)的變化。隨機(jī)效應(yīng)不確定度主要來(lái)自幾個(gè)方面，即樣品代表性、樣品均勻性、進(jìn)樣的重復(fù)性、體積刻度充滿的重復(fù)性、天平的重復(fù)性和儀器測(cè)量的重復(fù)性等。實(shí)驗(yàn)中對(duì)隨機(jī)抽取的樣品進(jìn)行3 次平行測(cè)定，對(duì)隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度進(jìn)行評(píng)定。3次測(cè)量的隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度根據(jù)下式計(jì)算：

表6 茶葉中聯(lián)苯菊酯殘留量的檢測(cè)結(jié)果Table 6 Analytical results of bifenthrin residues in tea

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.5 相對(duì)擴(kuò)展不確定度

95%置信水平下，取K=2，則：

2.6 擴(kuò)展不確定度

2.7 結(jié)果表示

用GC法測(cè)定茶葉中聯(lián)苯菊酯，結(jié)果為：

用GC-MS法測(cè)定茶葉中聯(lián)苯菊酯，結(jié)果為：

3 結(jié) 論

通過(guò)分析兩種方法各個(gè)步驟的不確定度，發(fā)現(xiàn)用GC法和GC-MS法測(cè)定茶葉中的聯(lián)苯菊酯的不確定度主要來(lái)自樣品前處理和標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算以及樣品測(cè)試過(guò)程中的隨機(jī)效應(yīng)。在樣品前處理過(guò)程中更加規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作來(lái)提高回收率，可以將前處理引入的不確定度進(jìn)一步減小。此外，選用更加精密的量器具也可以將不確定度進(jìn)一步減少。同時(shí)可以通過(guò)增加標(biāo)準(zhǔn)曲線各個(gè)點(diǎn)的測(cè)量次數(shù)和樣品的測(cè)量次數(shù)，改善標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性，減少標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品測(cè)試過(guò)程中隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度。而從總體來(lái)看，GC法的不確定度略低于GC-MS法，檢測(cè)結(jié)果具有更好的精密度。

[1]國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJF 1059—1999 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].

[2]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS—GL06 化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[S/OL].(2009-03-12)[2011-12-20].htttp: //www.simt.com.cn/art/2009/3/12/art_1903_6021.html.

[3]合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS-CL01 檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則(ISO/IEC 17025: 2005)[S].2006: 18-19.

[4]顏鴻飛, 張瑩, 黃志強(qiáng), 等.GB/T 23204－2008 茶葉中519 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定: 氣相色譜-質(zhì)譜法[S].北京: 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì), 2008.

[5]劉瀟威, 買光熙, 李凌云, 等.NY/T 761—2008 蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法[S].天津: 農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心, 2008.

[6]國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局.GB 12806—1991 實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶[S].北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1991.

[7]范巧成.Excel在線性回歸法測(cè)量不確定度評(píng)定中的應(yīng)用[J].理化分析: 化學(xué)分冊(cè), 2005, 1(9): 678-680.

[8]李愛(ài)軍, 盧利軍, 牟俊, 等.氣相色譜/氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食品中毒死蜱殘留量[J].農(nóng)藥, 2008(11): 828-831.

[9]余孔捷, 蔡春平, 楊方, 等.茶葉中聯(lián)苯菊酯、毒死蜱殘留量的測(cè)定能力驗(yàn)證分析[J].化學(xué)分析計(jì)量, 2011(2): 65-67.

[10]胡貝貞, 沈國(guó)軍, 邵鐵鋒, 等.加速溶劑萃取-氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留量[J].分析試驗(yàn)室, 2009, 28(1): 80-83.

[11]王新雄, 成秀娟, 徐偉松, 等.農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 39(5): 700-704.

[12]蔣永祥, 葉麗.茶葉中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量測(cè)定不確定度的評(píng)定[J].分析試驗(yàn)室, 2006, 25(12): 54-57.

[13]蔣萬(wàn)楓.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定蔬菜中毒死蜱農(nóng)藥殘留量的不確定度評(píng)定[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2012(4): 354-355; 357.

[14]丁立平.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定茶葉中氟蟲(chóng)腈的不確定度評(píng)定[J].分析測(cè)試技術(shù)與儀器, 2011, 17(3): 149-154.

[15]彭慧蓮, 成秀娟, 徐偉松, 等.蔬菜中毒死蜱等幾種農(nóng)藥殘留量測(cè)定不確定度分析[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2012, 33(4): 35-39.

[16]崔雁娜, 趙漢取, 韋肖杭, 等.氣相色譜法測(cè)定有機(jī)氯含量的不確定度評(píng)定[J].廣東化工, 2012, 39(5): 200-202.

[17]黃榮浪, 章虎, 王祥云, 等.氣相色譜法測(cè)定蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的測(cè)量不確定度[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(13): 7124-7127.

[18]韓紅新, 孫翠平, 吳莉宇, 等.測(cè)量不確定度在農(nóng)藥殘留分析測(cè)試中的應(yīng)用[J].上海計(jì)量測(cè)試, 2008, 35(1): 15-18.

[19]方學(xué)智, 費(fèi)學(xué)謙, 丁明, 等.玉米中氯氰菊酯、溴氰菊酯SPE凈化及不確定度分析[J].農(nóng)藥, 2009, 48(2): 127-129.

[20]胡貝貞, 宋偉華, 董文洪, 等.茶葉中聯(lián)苯菊酯等4 種農(nóng)藥殘留測(cè)定結(jié)果的不確定度評(píng)定[J].現(xiàn)代測(cè)量與實(shí)驗(yàn)室管理, 2012(1): 29-32.