王志鵬 張艷 王曉青

(清華大學化學系 北京100084)

對血紅蛋白可逆載氧的系統(tǒng)研究是生物無機化學領域的重要成果之一，其結構與功能的關系也一直是相關教學關注的重點。在近一個世紀以來的研究中，人們對于血紅蛋白的分子結構、載氧機理與生物學功能都有了較為全面的認識;但是對于其活性中心血紅素在結合氧分子前后的相關結構變化，目前仍然存在多種爭議，其中包括:血紅素中心的亞鐵離子在和氧分子結合的過程中是否發(fā)生了電子轉移?氧分子與血紅素鐵是端配位還是側配位?在脫氧狀態(tài)下是否有水分子占據(jù)第6個配位點?本文結合研究進展對這些爭議進行總結分析，以期加深對血紅蛋白結構功能的理解，輔助教學內容，并對血紅素類功能配合物的設計合成提供參考。

1 血紅素的結構與功能

血紅蛋白在高等動物體內起運載氧氣的作用。血紅蛋白［1］具有的四級結構為4個亞基構成的異源四聚體α2β2，其中每個蛋白亞基都結合一個血紅素輔基，且將其包裹于蛋白側鏈構成的疏水核心(圖1)。

圖1 血紅蛋白的四級結構圖

脫氧狀態(tài)的血紅素分子由卟啉與亞鐵離子配位形成。雖然不同血紅素分子的卟啉環(huán)外衍生結構不同，可以分為多種異構體，但其利用環(huán)上4個氮原子進行配位的方式是一致的。同時，蛋白中87位(α亞基)或92位(β亞基)的組氨酸殘基上的咪唑氮原子從卟啉環(huán)平面上方與亞鐵離子配位，構成第5配位點(圖2)。

圖2 血紅蛋白核心結構——血紅素鐵的配位情況示意圖

實驗證明，在脫氧血紅素中，亞鐵離子半徑較大(92pm)，不能嵌入卟啉環(huán)內，因而高出卟啉環(huán)平面60pm。當氧分子配位后，中心鐵離子半徑縮小至75pm而進入卟啉環(huán)平面。在結合氧分子過程中還伴隨著中心鐵離子的磁矩變化。在脫氧狀態(tài)下，血紅素鐵呈現(xiàn)順磁性;而在氧合狀態(tài)下呈反磁性［1］。

對于血紅素氧合前后鐵離子半徑和磁性變化的原因存在多種爭議，其中血紅素中心亞鐵離子在氧合過程中是否發(fā)生了電子轉移是最重要的一個。穆斯堡爾譜(M?ssbauer spectroscopy)只顯示中心鐵離子與氧分子之間有強的共價作用，但是難以對鐵離子的氧化態(tài)進行清楚的說明［2］。另外，IR譜中觀察到的O—O鍵的紅外伸縮振動頻率在數(shù)據(jù)與結論上都存在分歧［3］，但是明確的一點是O—O鍵的鍵級為1.5，與超氧負離子的鍵級相同［4］。Raman光譜也提供了一些數(shù)據(jù)［5］。不過由于中心鐵離子與氧分子配位前后的原子軌道、分子軌道發(fā)生重組，光譜數(shù)據(jù)以及鍵級、鍵長、鍵角等數(shù)據(jù)自然會發(fā)生變化。在沒有直接證據(jù)的情況下，直接對比配位前后的相關性質和譜學數(shù)據(jù)，從而得出支持某種假設的結論是不夠充分可靠的［6］。

另外還有兩個爭議，一是與鐵離子相結合的氧分子的配位方式，即是端配還是側配;二是脫氧血紅素中亞鐵離子是5配位，還是有水分子配位形成6配位。人們提出了不同的氧合理論模型，試圖對以上爭論進行解釋。

2 理論模型研究

由于以上實驗證據(jù)表明在脫氧血紅蛋白轉變?yōu)檠鹾涎t蛋白過程中存在某些復雜的結構變化和電子重排過程，人們對血紅素中鐵氧鍵合過程和結構提出了多種理論模型。

最早，Pauling運用經(jīng)典價鍵理論建立模型［7-9］對此過程進行說明:O2以端配方式與亞鐵離子結合，其中一個氧原子的一對孤對電子與鐵配位，未發(fā)生電子轉移，亞鐵離子由5配位高自旋狀態(tài)轉變?yōu)?配位低自旋，因而半徑縮小，由于電子配對，順磁性轉變?yōu)榉创判浴Ｑt素與一氧化碳結合的產(chǎn)物具有相似的分子結構，可以說明血紅素氧合后的配合物存在一種共振體，因而亞鐵-氧之間的鍵有部分雙鍵性質(圖3a)。

后來，Weiss提出電子轉移模型［10-11］，認為在血紅素與雙氧結合后，中心的亞鐵離子Fe(Ⅱ)首先轉移一個電子給O2形成超氧負離子，自身變成半徑較小的高鐵離子Fe(Ⅲ)，然后超氧負離子與高鐵離子配位。雖然低自旋的高鐵離子有一個未成對電子，本身呈順磁性，但是與同樣具有一個未成對電子的超氧負離子配位結合后，電子配對，各自的順磁性消失，整體顯示抗磁性(圖3b)。

除此之外，Griffith還提出另外一個側配氧合模型［12］。他通過對中心原子鐵及氧分子的軌道計算得出，其配位模式既不是垂直端配共振體，也不是傾斜端配共振體。結合自旋狀態(tài)分析，他認為O2是平行于卟啉-鐵配位平面進行配位的，即側配氧合，利用亞鐵離子空的d2sp3雜化軌道和O2的π2p軌道重疊形成σ鍵，而亞鐵離子的3dxz原子軌道上的電子可以和O2的軌道形成反饋π鍵(圖3c)。

圖3 氧合血紅素的多種理論模型

綜上，現(xiàn)在存在3種不同理論模型，下面對幾個爭議分別進行論述。

3 爭議一:氧合血紅素中鐵離子的氧化態(tài)問題

首先，對于結合雙氧前后血紅素中心亞鐵離子氧化態(tài)的變化情況長期存在爭議。

對公認的磁性與半徑變化的事實，Pauling理論解釋為Fe(Ⅱ)離子的電子自旋狀態(tài)的改變，這與鍵長、鍵角等數(shù)據(jù)也相符合［13］;Weiss模型則認為鐵(Ⅱ)被氧化為鐵(Ⅲ)，而不僅僅是電子自旋狀態(tài)的變化。中心原子氧化態(tài)的升高必然伴隨著半徑的減小和磁性的改變。前文提到在IR譜中觀察到O—O鍵的紅外伸縮振動頻率對應著O—O鍵的鍵級為1.5，與超氧負離子的鍵級相同［14］。此外，X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy)研究表明，中心鐵原子具有一個約為3.2的氧化態(tài)［15］。Durham等人［6］利用X射線吸收近邊結構光譜(X-ray absorption near edge structures)研究中心鐵離子在氧合過程前后的能級變化情況，證明鐵離子在氧合后有效正電荷增加了。這些都能夠被Weiss模型合理地解釋。

對于Pauling模型存在一些困惑。比如通過高自旋到低自旋的轉變看似能夠解釋磁性的變化，但是這同時要求氧分子首先由兩個電子自旋平行的三線態(tài)轉變?yōu)樽孕鋵Φ膯尉€態(tài)，這是一個能量上不利的過程。同時，在Pauling理論中，認為氧配位之后使八面體場的晶體場分裂能升高，從而導致中心亞鐵離子由順磁性的高自旋()轉變?yōu)榭勾判缘牡妥孕?)，進而使其半徑減小。在這個推理過程中，配位場分裂能的變化，以及高低自旋的轉變對半徑的影響，是缺乏直接量化證據(jù)的。相比之下，Weiss模型中亞鐵離子轉變?yōu)楦哞F離子，離子半徑自然減小的解釋更加直接有力。

但是，目前對Weiss模型最大的非議是典型的高鐵血紅素卻不具備可逆載氧功能。對于這一點，我們認為可以這樣解釋，一是因為在Weiss模型中，與鐵離子配位的實際上是超氧負離子，而不是空氣中直接存在的雙氧分子。故而，這一點不能作為否定Weiss模型的證據(jù)。另外，實驗［16］表明，從血紅蛋白中分離出的血紅素暴露在氧氣中時，氧分子會與兩個血紅素鐵以橋配配位，形成穩(wěn)定的Fe(Ⅲ)-O2-Fe(Ⅲ)產(chǎn)物，血紅素亞鐵被不可逆地氧化為血紅素高鐵。同時，珠蛋白鏈形成的疏水結構可以保護血紅素亞鐵在可逆載氧過程中不被氧化，這已被公認。因此我們可以認為，在Weiss模型中，從血紅素亞鐵離子到氧分子的一個電子轉移只發(fā)生在氧合配位體中，而且是可逆的。在脫氧過程中，受到外圍蛋白結構的保護，氧合配位體脫掉氧分子，血紅素恢復為亞鐵離子?？梢?，Weiss模型可以較為合理地解釋現(xiàn)有大部分現(xiàn)象而沒有明顯不合理之處。

氧合血紅素中鐵離子的氧化態(tài)之爭在教學體系中是非常分明的，因為涉及血紅蛋白的可逆載氧的氧合機理是非常重要的。歷史上Pauling模型有著廣泛的影響，目前國內外很多經(jīng)典教科書中都認同這一觀點。例如，Miessler［17］在《Inorganic Chemistry》中闡述血紅蛋白的存在可以保護血紅素鐵使其與氧氣結合后仍保持Fe(Ⅱ)形式，而不被氧化為Fe(Ⅲ)。麥松威［18］在《高等無機結構化學》中也強調了在血紅蛋白中，O2結合于Fe(Ⅱ)，不會氧化為Fe(Ⅲ)。隨著一些新的譜學實驗的研究，Weiss模型也得到越來越多的支持。Cotton［19］在《Advancd Inorganic Chemistry》中也提到，在脫氧條件下血紅素鐵是Fe(Ⅱ)高自旋;氧合后變?yōu)镕e(Ⅲ)低自旋，通過與超氧負離子結合而電子配對呈現(xiàn)反磁性。郭子建等在其《生物無機化學》教材［15］中支持氧合過程中的Weiss模型。

4 爭議二:雙氧配位方式

關于O2對于鐵離子的配位是彎曲型端配(bent end-on)還是側配(side-on)也一直存有爭議。在Griffith模型中，O2與血紅素中心鐵原子配位方式為側配;而在Pauling模型［7-9］和Weiss模型［10-11］中，O2以彎曲型端配方式與鐵結合。模型化合物和血紅蛋白、肌紅蛋白的X射線晶體衍射數(shù)據(jù)都證實雙氧與鐵離子以端配方式結合且有一定傾斜角。而M?ssbauer譜也證明O2既不是平行也不是垂直于血紅素平面。

最初因難以獲得準確的蛋白晶體結構數(shù)據(jù)，一系列與血紅蛋白復合體幾何構型相似的模型化合物被構建用來研究蛋白質結構與功能之間的關系［20］。血紅蛋白中氧氣對鐵的彎曲型端配結構最早在尖樁籬笆型復合體(“picket fence”complex)(圖4)中被觀測到［21-22］，后來人們在氧合肌紅蛋白［23］及氧合血紅蛋白［24］的晶體結構中也觀察到了這種配位方式(圖5)。氧合血紅素中的Fe—O—O鍵在不同物種的同源蛋白質及模型化合物中有特定角度，F(xiàn)e—O—O鍵的鍵角在Fe(TpivPP)(2-Melm)尖樁籬笆型復合物中為129°;在氧合無脊椎動物血紅蛋白中為170°，近乎為直線型［25］;在脊椎動物氧合肌紅蛋白中為115°［26］;在脊椎動物氧合血紅蛋白中為156°，介于尖樁籬笆型復合物和無脊椎動物血紅蛋白之間。

蛋白空腔的大小、雙氧與蛋白上特定氨基酸之間氫鍵的形成會影響Fe—O—O鍵角。例如，根據(jù)空間位置判斷，氧合血紅蛋白和氧合肌紅蛋白中α-亞基E7位的組氨酸上的Nε與O的間距是2.7?，有利于形成Nε—H┈O的氫鍵，氫鍵的強弱、α-亞基E7位組氨酸與雙氧的相對位置將影響Fe—O—O鍵角。

5 爭議三:鐵離子配位數(shù)問題

圖4 尖樁籬笆型鐵卟啉與雙氧以彎曲型端配方式結合［21-22］Fe(TpivPP)(2-Melm)(R1=CH3，R2=H)

圖5 氧合血紅蛋白和氧合肌紅蛋白的α-亞基實線表示氧合血紅蛋白，虛線表示氧合肌紅蛋白［24］

在氧合血紅蛋白中，血紅素鐵形成6配位結構，而且CO、NO等小分子極易取代O2與血紅素鐵形成彎型端配結構［27］。在生物體的脫氧血紅蛋白中，水是否與血紅素鐵配位也小有爭議。大部分教材描述脫氧血紅蛋白中亞鐵離子為5配位，因為血紅素所處的疏水蛋白結構應不利于水的配位結合;但也有研究［28］報告在脫氧血紅蛋白中，水分子可以作為血紅素鐵的軸向配體參與配位，即在脫氧情況下血紅素鐵為6配位。如果血紅素鐵在氧合前后都是6配位，即只是水分子被氧分子取代，則很難解釋血紅素鐵在氧合過程中的巨大結構變化。對于水分子與血紅素鐵的配位情況，目前所得的血紅蛋白及血紅素模型化合物的晶體結構顯示很少有水參與中心金屬的配位［19］。但Priedman等人［29］在研究Scapharca的二聚血紅蛋白結構時發(fā)現(xiàn)，在此血紅蛋白亞基界面上有水分子團簇結構。根據(jù)二聚血紅蛋白晶體結構，脫氧二聚血紅蛋白的血紅素鐵可與水分子配位。他們用定點突變、改變滲透壓的方法進一步研究水分子配位對血紅蛋白功能的影響，發(fā)現(xiàn)將Scapharca血紅蛋白的72位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸后，氧氣對血紅蛋白的親和性提高了40倍;造成這一結果的最重要差異就是:突變后血紅蛋白中的血紅素鐵與水分子的結合能力變弱了。此外，增加滲透壓將降低人血紅蛋白對氧氣的親和性，這說明水分子和氧氣在與血紅素鐵配位時存在競爭關系，人血紅蛋白中血紅素鐵可能與水分子存在類似的弱配位鍵。

綜上所述，目前只在極少數(shù)血紅蛋白晶體中觀察到了水與血紅素鐵的配位。一般認為，脫氧時血紅素鐵為5配位，即血紅素鐵不與水分子配位。

6 結論

對于血紅蛋白中血紅素的氧合過程及氧合前后的結構變化，人們采用了多種物理和化學手段進行研究，獲得了豐富的數(shù)據(jù)?；诖?，人們提出了Pauling模型、Weiss模型等不同的理論模型試圖解釋血紅蛋白的氧合機理，但是對其具體結構某些方面的認識仍然存在一些爭議。本文通過分析比較幾種理論模型，結合相關研究的最新進展，對目前教學中有爭議的問題進行了梳理和總結，提出相關看法。對于氧合過程中鐵離子的氧化態(tài)問題，我們認為Weiss理論中Fe(Ⅲ)與超氧負離子的配位模型比較合理;對于O2配位方式的爭議，目前已基本解決，晶體結構表明其為彎曲型的端配;對于脫氧血紅素中鐵離子的配位數(shù)其實爭議不大，均認為是5配位。但某些研究表明在脫氧情況下，一些物種的血紅素鐵可與水、組氨酸和卟啉環(huán)形成6配位結構，值得關注。

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