韓秀清，付雪媛，徐 杰，董 平，王靜鳳，薛長(zhǎng)湖，王玉明

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

海參和海星皂苷對(duì)乳清酸誘導(dǎo)大鼠脂肪肝影響的比較研究

韓秀清，付雪媛，徐 杰，董 平，王靜鳳，薛長(zhǎng)湖，王玉明*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

目的：研究并比較海參皂苷和海星皂苷對(duì)乳清酸誘導(dǎo)的長(zhǎng)期大鼠非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的干預(yù)作用。方法：將雄性Wistar大鼠喂食1%乳清酸建立NAFLD模型，連續(xù)喂養(yǎng)6 周后，將大鼠分為乳清酸模型組（orotic acid group，OA）、海參皂苷組（sea cucumber saponins group，Scs）和海星皂苷組（starfish saponins group，Sfs），以未喂食OA的大鼠為正常對(duì)照組（control group，Con）繼續(xù)喂養(yǎng)8周后，分別測(cè)定大鼠肝臟甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、磷脂（phospholipid，PL）水平和血清TG、TC水平以及肝臟脂質(zhì)合成、分解相關(guān)酶的酶活性和基因表達(dá)量。結(jié)果：海參皂苷和海星皂苷組肝脂及血脂水平均有明顯下降，此外，二者均能抑制脂肪酸合成酶活性，下調(diào)脂肪酸合成基因表達(dá)水平，增強(qiáng)脂肪酸β-氧化相關(guān)酶活性。結(jié)論：海參皂苷和海星皂苷均能明顯改善乳清酸長(zhǎng)期誘導(dǎo)大鼠NAFLD，并具有類似的調(diào)控機(jī)制，其中海參皂苷和海星皂苷的改善效果相當(dāng)。

非酒精性脂肪肝；海參皂苷；海星皂苷；乳清酸

近年來，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病率明顯升高，并呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì)[1-3]。目前，尋找能夠改善NAFLD的天然活性物質(zhì)和食品功效成分是海洋食品研究的重要內(nèi)容之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，海洋棘皮動(dòng)物海參由來的皂苷類化合物可有效抑制大鼠非酒精性脂肪肝的形成過程[4]。我國部分沿海具有食用海星習(xí)慣，海星同屬于海洋棘皮動(dòng)物，是海洋動(dòng)物皂苷的另一主要來源[5]。海參皂苷和海星皂苷雖同屬于海洋棘皮動(dòng)物皂苷，但前者主要為三萜類皂苷，后者主要為甾體類皂苷，結(jié)構(gòu)上的差異提示二者可能具有不同的生理活性[6-9]。本實(shí)驗(yàn)采用乳清酸建立大鼠長(zhǎng)期NAFLD模型，比較研究了海參皂苷和海星皂苷對(duì)長(zhǎng)期NAFLD的治療和干預(yù)作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討，為海星皂苷和海參皂苷的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（180±10）g，許可證號(hào)：SCXK（京）2007-0001，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.2 材料與試劑

甘油三酯（triglyceride，TG）測(cè)定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒、葡萄糖測(cè)定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測(cè)定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）測(cè)定試劑盒、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol抽提試劑 美國Invitrogen公司；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 美國Promega公司；HP型大孔樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司；AB-8型大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

Aglient1100型高效液相色譜儀 美國Aglient 公司；iQ5型Realtime PCR儀、Model680型酶標(biāo)儀 美國Bio Rad公司；UV-2550型分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.4 方法

1.4.1 海參皂苷和海星皂苷的制備

參照董平[10]的方法制備海參皂苷。革皮氏海參經(jīng)干燥粉碎制成粉末，加60%乙醇熱回流抽提6次，合并各次抽提所得上清液，減壓回收乙醇，得水溶液，過HP-20型大孔樹脂，依次用水和80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液減壓濃縮，經(jīng)真空冷凍干燥后得海參皂苷。

參照張錚[11]的方法制備海星皂苷。新鮮海星8 kg，加95%乙醇12 L浸提過夜得上清液，再加入60%乙醇溶液反復(fù)浸提2 次，合并各次抽提所得上清液，減壓回收乙醇，得水溶液，過AB-8型大孔樹脂，依次用水和80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液減壓濃縮，經(jīng)真空冷凍干燥后得海星皂苷。

1.4.2 動(dòng)物分組與喂養(yǎng)

動(dòng)物先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，之后將Wistar大鼠按體質(zhì)量分為2 組：正常對(duì)照組（Con，n=8）和乳清酸組（n=24），分別喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料和1%乳清酸飼料6 周后，將乳清酸組隨機(jī)分為模型組（OA組，n=8）、海參皂苷組（Scs，n=8）及海星皂苷組（Sfs，n=8），分別喂食1%乳清酸飼料、分別含0.04%海參皂苷和0.04%海星皂苷的1%乳清酸飼料，飼養(yǎng)8 周?；贏IN93M基礎(chǔ)飼料配方配制各組飼料，飼料配方見表1。大鼠自由攝食飼料和飲水，在室溫（23±2）℃，明暗交替各12 h條件下喂養(yǎng)。飼料每日更新并測(cè)定攝食量，并記錄每周體質(zhì)量變化。喂食14 周后于前夜禁食不禁水5 h后，乙醚麻醉下腹主動(dòng)脈取全血處死，取肝臟、腎周脂肪、附睪脂肪等臟器組織稱質(zhì)量后，液氮速凍后于－80 ℃保存，備用。

表1 各組飼料配方Table 1ble 1 Compositions of experimental diet

1.4.3 肝臟脂質(zhì)含量、血清指標(biāo)測(cè)定

參照Folch等[12]的方法，準(zhǔn)確稱取0.25 g肝臟，制成肝臟脂質(zhì)抽提液，參照試劑盒說明書分別測(cè)定肝臟TC、TG含量。血液室溫靜置30 min后，7 500 r/min離心獲得血清，參照試劑盒說明書測(cè)定血清TG、TC、葡萄糖、AST、ALT、GGT水平等血清理化指標(biāo)。

1.4.4 肝臟脂肪代謝相關(guān)酶活性測(cè)定

用含有0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA和10 mmol/L Tris的緩沖液（pH 7.4）于4 ℃制備肝勻漿，以750×g離心10 min，去除沉淀。上清液先以12 000×g離心20 min，收集沉淀，按文獻(xiàn)[13-14]方法用于肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitin palmitoyl transferase-1，CPT-1）、過氧化物酶體β-氧化酶系活性測(cè)定。二次離心所得上清液再以125 000×g離心60 min，收集上清液用于測(cè)定脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、蘋果酸酶（malic enzyme，ME）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）活性，方法參照文獻(xiàn)[15-16]。

1.4.5 基因mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用Trizol提取肝臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。各基因的mRNA表達(dá)量均以18sRNA量比值表示，并將對(duì)照組定為100%。實(shí)驗(yàn)中所用到的引物序列如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)中所需引物序列Table2 Primers used in this study

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體質(zhì)量、攝食量及臟器質(zhì)量變化

圖 1長(zhǎng)期攝食海參皂苷和海星皂苷對(duì)NAFLD大鼠體質(zhì)量影響（n＝8）Fig.1 Effects of sea saponins and starfish saponins on body weight in rats (n=8)

表3 長(zhǎng)期攝食海參皂苷和海星皂苷對(duì)大鼠生長(zhǎng)指標(biāo)和各組織器官影響（n＝8）Table3 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on growth parameters and organs in rats (n=8)

由圖1可知，各組大鼠體質(zhì)量均無明顯差異，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了腎周脂肪和附睪脂肪等內(nèi)臟脂肪組織含量，各組比較均無明顯差異，但由于乳清酸誘導(dǎo)脂肪肝模型中，機(jī)體脂肪代謝紊亂，大量脂肪沉積在肝臟，即異位脂肪沉積作用[17]，模型組的內(nèi)臟脂肪含量為各組中最低。與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟質(zhì)量顯著增加了63.0%（P＜0.001），海參皂苷和海星皂苷對(duì)大鼠肝臟質(zhì)量無明顯影響（表3）。

2.2 大鼠肝臟脂質(zhì)含量變化

圖2 長(zhǎng)期攝食海參皂苷和海星皂苷對(duì)NAFLD大鼠肝脂質(zhì)水平影響（n＝8）Fig.2 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on hepatic lipids in rats (n = 8)

如圖2所示，喂食乳清酸14 周后，模型組大鼠肝臟TG、TC水平分別是對(duì)照組的12.4、2.82倍（P＜0.05），海參皂苷和海星皂苷干預(yù)后，與模型組相比，大鼠肝臟TG含量分別下降了38.3%和41.2%，肝臟TC含量分別下降了32.4%和18.4%。

2.3 血清中脂質(zhì)和肝功能酶學(xué)指標(biāo)變化

圖3 長(zhǎng)期攝食海參皂苷和海星皂苷對(duì)NAFLD大鼠血清指標(biāo)影響（n＝8）Fig.3 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on serum indexes in rats (n = 8)

2.4 肝臟脂肪酸合成酶活性變化

圖4 長(zhǎng)期攝食海參皂苷和海星皂苷對(duì)肝臟脂肪酸合成相關(guān)酶活性的影響（n＝8）8Fig.4 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the hepatic enzyme activities involved in fatty acid biosynthesis in rats (n = 8)

如圖3所示，與正常組相比，模型組血清TG水平下降了20.6%。與模型組相比，海參皂苷組和海星皂苷組血清TG水平分別降低了61.8%（P＜0.05）和51.4%（P＜0.05），血清TC水平無顯著性差異。血清中AST、ALT、GGT活性測(cè)定結(jié)果顯示，模型組大鼠血清AST、ALT、GGT活性分別是對(duì)照組的5.2、2.9和1.2 倍（P＜0.05）。海參皂苷和海星皂苷不同程度地下調(diào)了血清GGT活性，此外，海星皂苷明顯下調(diào)了血清ALT活性（P＜0.05），而海參皂苷對(duì)血清ALT和AST活性無明顯調(diào)控作用。

如圖4所示，長(zhǎng)期喂食乳清酸后，大鼠肝臟ME酶活性顯著上升，而G6PDH酶活性卻有所下降。海參皂苷和海星皂苷干預(yù)后，大鼠肝臟ME酶活性分別下降了17.5%和40.5%（P＜0.05）；但是，海參皂苷對(duì)G6PDH酶活性無顯著影響，海星皂苷卻顯著上調(diào)了G6PDH酶活性。FAS是內(nèi)源性長(zhǎng)鏈脂肪酸合成過程中的最后一步的限速酶，長(zhǎng)期喂食乳清酸后大鼠肝臟FAS酶活性顯著下降（P＜0.05），兩皂苷干預(yù)后雖無顯著性變化，但表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。

2.5 肝臟脂肪酸β-氧化酶活性變化

圖5 長(zhǎng)期攝食海參皂苷和海星皂苷對(duì)肝臟脂肪酸β-氧化相關(guān)酶活性的影響（n＝8）Fig.5 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the hepatic enzyme activities involved in fatty acid -oxidation in rats (n = 8)

如圖5所示，脂肪肝模型組大鼠肝臟CPT-1酶活性和過氧化物酶體β-氧化酶系活力均顯著下降，說明模型組肝臟的脂肪β-氧化能力受到明顯抑制。海參皂苷和海星皂苷干預(yù)后，大鼠肝臟CPT-1和過氧化物酶體β-氧化酶系能力均顯著上升，表明海參皂苷和海星皂苷能顯著促進(jìn)肝臟脂肪酸的分解利用。

2.6 肝臟脂肪酸合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的變化

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding proteins1，SREBP1）可調(diào)控脂肪合成代謝酶，如FAS的基因表達(dá)[18-19]。如圖6所示，海參皂苷組和海星皂苷組大鼠肝臟SREBP1-c、FAS和ME的mRNA表達(dá)水平均有顯著下調(diào)（P＜0.05），其中海參皂苷組的FAS和ME基因表達(dá)下調(diào)尤為明顯，分別下調(diào)了66.4%和38.5%，而海星皂苷組的SREBP1-c和G6PDH基因下調(diào)尤為明顯，分別下調(diào)了33.6%和36.7%（P＜0.05），表明海參皂苷和海星皂苷可能通過下調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)抑制肝臟的脂肪合成，且綜合看來，二者的調(diào)節(jié)水平相當(dāng)。

圖6 長(zhǎng)期攝食海參皂苷和海星皂苷對(duì)大鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響（n＝8）8Fig.6 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the mRNA expression levels related to fatty acid biosynthesis in rats (n = 8)

2.7 肝臟脂肪酸分解相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的變化

圖7 長(zhǎng)期攝食海參皂苷和海星皂苷對(duì)大鼠肝臟脂肪酸β-氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響（n＝8）Fig.7 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the mRNA expression levels related to fatty acid β-oxidation in rats (n = 8)

過氧化物酶體增殖物激活受體-α（peroxisome proliferators activated receptor-α，PPAR-α）參與脂肪酸β-氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了肝臟PPAR-α及其靶基因的mRNA表達(dá)量變化。結(jié)果表明，乳清酸飲食引起肝臟PPAR-α基因及其靶基因CPT-1和ACO不同程度上的表達(dá)下調(diào)，但各皂苷組和乳清酸模型組相比，3 種基因的表達(dá)水平都無明顯變化。

3 討 論

已有報(bào)道表明海參皂苷對(duì)NAFLD的形成和發(fā)展階段具有預(yù)防作用。Hu Xiaoqian等[20]通過大鼠短期喂養(yǎng)模型，研究發(fā)現(xiàn)海參皂苷對(duì)乳清酸誘導(dǎo)的NAFLD有較好的預(yù)防作用，但其主要探討海參皂苷對(duì)NAFLD形成期間機(jī)體脂肪代謝的影響。本實(shí)驗(yàn)通過長(zhǎng)期喂食乳清酸建立大鼠NAFLD模型后再給予海參皂苷和海星皂苷的干預(yù)，探究其對(duì)乳清酸誘導(dǎo)NAFLD的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：海參皂苷明顯降低了肝臟以及血清TG的含量，對(duì)乳清酸誘導(dǎo)大鼠NAFLD有較好的干預(yù)和改善效果。

已有研究表明，乳清酸誘導(dǎo)脂肪肝模型中肝臟TG的蓄積以及血清TG含量的降低與其分泌脂蛋白能力降低有關(guān)[21]。為了明確海參皂苷降低肝臟脂質(zhì)水平的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了肝臟脂肪酸代謝相關(guān)酶活性和基因水平。臟脂質(zhì)代謝過程中，ME 和G6PDH為脂肪酸合成提供NADPH。FAS可催化乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成脂肪酸，是肝臟脂肪酸合成的關(guān)鍵限速酶[22-23]。動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行脂肪酸β-氧化代謝的場(chǎng)所主要包括線粒體、過氧化物酶體，其中CPT是線粒體脂肪酸β-氧化的限速酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海參皂苷在不同程度上抑制了脂肪合成相關(guān)酶FAS和ME的酶活性，并明顯提升了肝臟脂肪酸氧化相關(guān)酶CPT的酶活性和過氧化物酶體β-氧化能力，這與Hu Xiaoqian等[20]的研究結(jié)果一致。但是，與已有研究不同的是，本實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)期喂食海參皂苷后大鼠肝臟G6PDH的酶活性并未降低，這可能與乳清酸喂養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。此外，海參皂苷下調(diào)了肝臟脂肪合成相關(guān)基因SREBP1-c、FAS、ME的mRNA表達(dá)水平，但對(duì)脂肪酸β-氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平并無明顯影響。也有研究表明，海參皂苷可以通過抑制消化道內(nèi)胰脂肪酶的活性，抑制和減緩的脂質(zhì)吸收，從而起到降低肝臟脂質(zhì)的作用[24]。因此，海參皂苷對(duì)肝臟脂質(zhì)過度蓄積的改善作用較為復(fù)雜，是多因素共同作用的結(jié)果。

海星中含有的海星皂苷與海參皂苷結(jié)構(gòu)顯著不同，研究結(jié)果證實(shí)，海星皂苷具有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒、抗炎癥、抗?jié)?、麻醉和降血壓等多種藥理活性[25]。到目前為止，國內(nèi)外有關(guān)海星皂苷對(duì)脂質(zhì)代謝影響的報(bào)道較少，更未見海星皂苷對(duì)NAFLD影響的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)探究了海星皂苷對(duì)乳清酸長(zhǎng)期誘導(dǎo)NAFLD的改善作用，并將其與同屬于海洋皂苷的海參皂苷進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海星皂苷同樣通過抑制肝臟脂肪合成氧化相關(guān)基因表達(dá)和酶活性改善乳清酸長(zhǎng)期誘導(dǎo)的NAFLD。

綜上所述，海參皂苷和海星皂苷均能在乳清酸誘導(dǎo)NAFLD形成以后，通過調(diào)節(jié)脂肪酸合成和β-氧化分解相關(guān)酶活性以及相關(guān)基因表達(dá)量改善機(jī)體的脂肪代謝異?，F(xiàn)象，且海參皂苷和海星皂苷的改善效果相當(dāng)。

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Effects of Sea Cucumber Saponins versus Starfish Saponins on Orotic Acid-Induced Fatty Liver in Rats

HAN Xiu-qing, FU Xue-yuan, XU Jie, DONG Ping, WANG Jing-feng, XUE Chang-hu, WANG Yu-ming*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: In this research, the effects of sea cucumber saponins and starfish saponins on nonalcoholic fatty liver induced by orotic acid (OA) in rats were comparatively investigated. Methods: Modified AIN-93G diet containing 1% orotic acid (OA diet) was used to establish NAFLD rat model. After 6-week feeding of OA diet, 24 male Wistar rats were randomly divided into three groups (eight rats in each group) and then fed with the corresponding diets for 8 weeks: OA group; OA diet; Scs group: OA diet containing 0.04% sea cucumber saponins; Sfs group: OA diet containing 0.04% starfish saponins. The rats fed the modified AIN-93M diet were used as a control group (Con). After 14 weeks of feeding, body weights, liver weights, visceral adipose weights, serum triglyceride (TG), serum total cholesterol (TC), liver functional indexes, hepatic TG, hepatic TC and hepatic phospholipids (PL) were measured. The enzyme activities and gene expressions involved in hepatic lipid metabolism were also determined. Results: Compared with the OA group, sea cucumber saponins and starfish saponins significantly reduced hepatic TG and TC levels (P ＜ 0.05). These two saponins alleviated the fatty liver through inhibiting the enzymes activities and gene expressions involved in hepatic lipogenesis and enhancing the activities of peroxisomal β-oxidation enzymes in liver. Conclusion: In summary, sea cucumber saponins and starfish saponins could efficiently alleviate NAFLD induced by orotic acid in rats with similar regulatory mechanisms. Meanwhile, sea cucumber saponins revealed similar lipid-lowering effects as sea starfish saponins.

nonalcoholic fatty liver disease; sea cucumber saponins; starfish saponins; orotic acid

TS218

A

1002-6630（2014）23-0268-06

10.7506/spkx1002-6630-201423052

2014-06-15

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B07）；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目

韓秀清（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)化學(xué)與分子營養(yǎng)學(xué)。E-mail：hxiuqing@126.com

*通信作者：王玉明（1973—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)學(xué)。E-mail：wangyuming@ouc.edu.cn