李世忠，黃建國(guó)，李治玲，彭良志，李 勇,*

（1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400715）

柑橘皮渣降解菌的篩選及特性

李世忠1，黃建國(guó)1，李治玲1，彭良志2，李 勇1,*

（1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400715）

為有效處理柑橘皮渣，篩選高效降解柑橘皮渣的菌株。本實(shí)驗(yàn)從堆肥中分離得到5 株菌株，測(cè)定其香精油耐受性，選取兩株耐受性較好的菌株測(cè)定纖維素酶和果膠酶活力，并進(jìn)行柑橘皮渣降解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，菌株L207和L702在65 ℃條件下可正常生長(zhǎng)，屬于耐高溫菌株；對(duì)柑橘香精油具有較好的耐受能力，其最大耐受體積分?jǐn)?shù)為25.0%；2 株菌株的纖維素酶活力和果膠酶活力分別是對(duì)照菌株（Bacillus subtilis L520）的1.31、2.08 倍和12.68、7.30 倍。柑橘皮渣降解實(shí)驗(yàn)表明，菌株能快速高效分解纖維素和果膠。16S rDNA基因序列分析鑒定表明菌株L207和L702均屬于地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

柑橘皮渣降解菌；柑橘精油；纖維素酶；果膠酶；16S rDNA

我國(guó)是柑橘的重要原產(chǎn)地之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)2011年，我國(guó)柑橘種植面積3 300萬畝，產(chǎn)量已達(dá)到2 900萬 t，面積和產(chǎn)量均位居世界第一。柑橘除少量直接食用外，大部分用于果汁加工，目前我國(guó)柑橘產(chǎn)量的約100萬t用于加工，每年約產(chǎn)生60萬t皮渣，隨著加工業(yè)的發(fā)展，皮渣量還要逐漸增加[1]。無（低）能耗處理柑橘皮渣是一個(gè)世界性的難題。大量的皮渣未能及時(shí)有效處理，污染水源，土壤和空氣，嚴(yán)重影響人們的生產(chǎn)、生活及健康[2]，已經(jīng)成為柑橘加工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展重要瓶頸問題之一，亟需解決。

國(guó)內(nèi)外目前柑橘皮渣主要通過衛(wèi)生填埋、烘干做動(dòng)物飼料，提取活性成分等處理方法[3-4]。國(guó)內(nèi)目前多數(shù)采用填埋處理，但是由于柑橘皮渣含水量可達(dá)80%左右，衛(wèi)生填埋產(chǎn)生大量滲透液，破壞填埋廠，污染土壤、水體和空氣；柑橘皮渣含有果膠和大量水分，烘干需要消耗大量能量，美國(guó)、巴西等柑橘加工大國(guó)由于能源價(jià)格低，規(guī)模大，多采用烘干做動(dòng)物飼料處理，可實(shí)現(xiàn)一定的效益[5]，國(guó)內(nèi)由于能源價(jià)格高，規(guī)模小，雖然能夠運(yùn)行，但難于實(shí)際應(yīng)用；提取皮渣中的香精油，色素，果膠等活性成分[6-8]，雖然可以增加皮渣的產(chǎn)值[9]，但在一定程度上增加了廢棄物的種類，污染問題并沒有消除。綜上所述，目前并未找到一種既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保又適合我國(guó)的柑橘皮渣處理方式。

柑橘皮渣含有約80%的水分，還含有約0.5%～2.0%柑橘香精油、20%果膠和15%纖維素[10]。研究[11]表明柑橘香精油對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌均有廣譜抑制作用，普通微生物很難以柑橘皮渣為基質(zhì)生長(zhǎng)，是柑橘皮渣發(fā)酵分解困難的重要原因之一。其次柑橘皮渣含有果膠和纖維素等大分子物質(zhì)，外圍包裹木質(zhì)素[12]，進(jìn)一步增加了普通微生物降解皮渣的難度。普通的堆肥是一種有效的柑橘皮渣資源化處理和利用有效方式，但是處理過程必須添加大量的輔料，添加比例達(dá)到50%～80%，以稀釋香精油濃度和為微生物生長(zhǎng)提供必要的碳源，增加了產(chǎn)業(yè)化處理的成本和難度。因此，研篩選和研究既具有抗香精油特性，又具有高效果膠、纖維素分解能力的優(yōu)良的微生物菌株的研究工作具有重要的理論和實(shí)踐意義。

本研究通過高溫及拮抗實(shí)驗(yàn)，篩選出耐受高濃度柑橘香精油、在高溫、低pH值條件下具有高效纖維素酶活性和果膠酶活性菌株，測(cè)定其相關(guān)活性，開展柑橘皮渣降解實(shí)驗(yàn)，尋找一種既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的柑橘皮渣資源化利用的處理方式，以期為柑橘皮渣產(chǎn)業(yè)化處理應(yīng)用提供重要的菌株資源和理論技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

對(duì)照菌株：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）L520，西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；菌株L106、L202、L207、L309、L702，從堆肥中分離獲得。

供試柑橘皮渣由重慶三峽建設(shè)集團(tuán)有限公司忠縣果汁廠提供，皮渣共1 000 kg。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，用于細(xì)菌的初步分離純化和菌株保藏。

纖維素剛果紅培養(yǎng)基[13]：羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na）2 g、(NH4)2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、NaCl 0.5 g、剛果紅4 g、瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值，用于纖維素降解菌的篩選分離。

果膠剛果紅培養(yǎng)基[14]：果膠5 g、(NH4)2SO42 g、MgSO4·7H2O 1 g、瓊脂15～20 g、剛果紅0.15 g，用于果膠降解菌的篩選分離。

液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g、(NH4)2SO44 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、蛋白胨1 g、酵母膏10 g，蒸餾水1 000 mL。

液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶培養(yǎng)基：果膠5 g、酵母膏5 g、(NH4)2SO42 g、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.3 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑

柑橘香精油（從柑橘皮渣中利用溶液浸提法提取，檸烯含量（主要成分）約80%為提取后香精油原始含量） 重慶市三峽建設(shè)集團(tuán)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 美國(guó)Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

1.2.1.1 耐高溫菌株分離與純化

將采集的堆肥樣品通過稀釋涂布平板法接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，放置在55、60、65、70、75 ℃溫度條件下培養(yǎng)24 h，挑起單菌落到試管斜面中，再通過平板劃線法純化備用。分離得到在55 ℃正常生長(zhǎng)的菌株5 株（L106、L202、L207、L309、L702）。

1.2.1.2 耐受柑橘香精油菌株篩選

采用抑菌圈測(cè)定法[15]，分別挑起菌株（L106、L202、L207、L309、L702）和枯草芽孢桿菌L520（對(duì)照菌株）3 環(huán)于無菌水中混勻獲得菌懸液，吸取0.2 mL菌懸液均勻涂布于牛肉膏固體培養(yǎng)基上，形成平板。配制不同體積分?jǐn)?shù)柑橘香精油（50%、25%、12.5%、6.25%、5%），取直徑0.6 cm已滅菌的圓形濾紙片若干，浸潤(rùn)后備用。將上述濾紙片，放置于平板，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量相關(guān)抑菌圈直徑大小。

1.2.2 纖維素酶和果膠酶活力測(cè)定

1.2.2.1 纖維素酶活力測(cè)定

粗酶液的提取：接種量為4%，以CMC-Na為唯一碳源的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，在37 ℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)3 d，于10 000 r/min、4 ℃離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

酶活力測(cè)定：采用羧甲基纖維素酶-3,5-二硝基水楊酸（carboxymethyl cellulose enzyme-3,5-dinitrosalicylic acid，CMCA-DNS）法[16-17]，即反應(yīng)體系中含有2 mL CMC-Na底物溶液，待測(cè)酶液0.5 mL（空白管不加酶液），于50 ℃恒溫水浴，準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，再加入3 mL DNS試劑（空白管加0.5 mL酶液），同時(shí)置于沸水浴中，加熱10 min，冷卻至室溫，定容至25 mL，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值，通過查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。

酶活力單位定義：在上述測(cè)定條件下，每分鐘水解纖維素產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.2.2 果膠酶活力測(cè)定

粗酶液的提?。航臃N量為4%，以果膠為唯一碳源的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，在37 ℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)2 d，于10 000 r/min、4 ℃離心15 min，所得上清液即為粗酶液。

酶活力測(cè)定：采用DNS法[18]，即反應(yīng)體系中含有1.8 mL果膠底物溶液，待測(cè)酶液0.2 mL（空白管不加酶液），于50 ℃恒溫水浴，準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，在加入2 mL DNS試劑，空白管加入0.2 mL酶液同時(shí)置于沸水浴，加熱10 min，冷卻至室溫，定容至15 mL，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，通過查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。

酶活力單位定義：在上述測(cè)定條件下，每小時(shí)水解果膠產(chǎn)生1 μmol還原糖（半乳糖醛酸）所需酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.3 菌株L702和L207的16S rDNA序列鑒定

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取L702和L207，具體方法參照文獻(xiàn)[19]。以16S rDNA通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增體系為25 μL：dNTP 2 μL，Mg2+1.5 μL，Buffer 2.5 μL，Primer各1 μL，ddH2O 15.8 μL，Taq酶 0.2 μL，模板1 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 1min、53 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃終止。

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，送至華大基因公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的DNA序列，輸入GenBank，用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析，利用DNAMAN中的MegAlign軟件構(gòu)件16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株L207和L702的皮渣降解實(shí)驗(yàn)

將菌株L207和L702用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液37 ℃揺瓶培養(yǎng)48 h，備用。按照m（新鮮皮渣）∶m（米糠）∶m（菌液）∶m（石灰）∶m（尿素）=100∶20∶2∶8∶5的比例混勻，其中皮渣共1 000 kg，堆置發(fā)酵，約3～5 d后溫度上升，最高溫度約68 ℃，堆置發(fā)酵期間，每10 d翻堆一次，約50 d左右發(fā)酵結(jié)束。每10 d取樣一次，分別分析測(cè)定其水分、氮磷鉀[20]、纖維素[21]和果膠[22]含量。由于在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，不接種微生物菌劑的柑橘皮渣均發(fā)生嚴(yán)重腐敗，產(chǎn)生大量臭氣，使得皮渣發(fā)酵不能正常進(jìn)行，所以該實(shí)驗(yàn)沒有設(shè)置不接種菌劑的處理。同時(shí)實(shí)驗(yàn)所使用底料比例是在多次預(yù)備實(shí)驗(yàn)中獲得的。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本計(jì)算和作圖，DPS 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最小顯著性差異（least-significant difference，LSD）法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株對(duì)柑橘精油的耐受性

由表1可知，不同體積分?jǐn)?shù)香精油對(duì)供試菌株的抑菌圈直徑明顯小于對(duì)照菌株，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；不同菌株對(duì)香精油的耐受力不同，隨著體積分?jǐn)?shù)增加，香精油抑制作用均明顯增加。在柑橘香精油體積分?jǐn)?shù)為12.5%時(shí)，菌株L106、L202、L309的生長(zhǎng)受到抑制作用，而L207和L702無抑制作用，說明菌株L106、L202和L309的耐受香精油體積分?jǐn)?shù)約為12.5%；當(dāng)香精油體積分?jǐn)?shù)增加為25%時(shí)，菌株L207和L702出現(xiàn)一定抑菌圈，說明L207和L702菌株的耐受香精油最高體積分?jǐn)?shù)約為25%，因此菌株L702和L207相對(duì)其他菌株對(duì)柑橘香精油有較強(qiáng)的耐受力。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)柑橘香精油對(duì)菌株的抑菌圈（±s，n＝4）Table1 Diameter of inhibition cycle of essential oil on the strains±s, ｎ=4)

表1 不同體積分?jǐn)?shù)柑橘香精油對(duì)菌株的抑菌圈（±s，n＝4）Table1 Diameter of inhibition cycle of essential oil on the strains±s, ｎ=4)

注：“0”表示未檢測(cè)到抑菌圈；同行小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；同列大寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

菌株抑菌圈直徑/cm 5%12.5%25%32.5%50% L1060.00±0.00dB0.80±0.07cC0.83±0.02cC1.43±0.12bB1.73±0.04aBL2020.00±0.00eB0.87±0.03dC1.17±0.11cB1.43±0.11bB1.67±0.10aBL3090.00±0.00dB0.97±0.05cB1.23±0.09bB1.67±0.21aA1.77±0.16aBL2070.00±0.00dB0.00±0.00dD0.87±0.04cC0.97±0.09bC1.20±0.12aCL7020.00±0.00cB0.00±0.00cD0.80±0.05bC0.83±0.06bC1.20±0.09aC對(duì)照0.87±0.07dA1.27±0.09cA1.47±0.12cA1.73±0.10bA1.93±1.19aA

2.2 纖維素降解酶和果膠降解酶的活性

圖1 菌株的纖維素酶（A）和果膠酶活性（B）Fig.1 The activities of cellulase (A) and pectinase (B) in L207 and L702

由圖1A可知，菌株L207和L702的纖維素降解酶活性均顯著大于對(duì)照菌株，分別是對(duì)照菌株的1.31 倍和2.08 倍，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。由圖1B可知，菌株L207和菌株L702果膠降解酶活性均顯著大于對(duì)照菌株，分別是對(duì)照菌株的12.68 倍和7.30 倍，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

2.3 菌株L207和L702柑橘皮渣降解能力

表2 菌株L207和L702降解柑橘皮渣各成分含量隨時(shí)間變化（±s，n＝4）Table2 Temporal evolution of citrus pomace components during fermentation by either L207 or L70(±s,ｎ=4)

表2 菌株L207和L702降解柑橘皮渣各成分含量隨時(shí)間變化（±s，n＝4）Table2 Temporal evolution of citrus pomace components during fermentation by either L207 or L70(±s,ｎ=4)

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

%時(shí)間/d水分纖維素果膠全氮P2O5K2O 074.97±1.23a32.30±2.90a15.32±1.09a0.91±0.07d0.25±0.03d0.67±0.05de1064.97±3.92b21.13±1.47b4.22±0.86b1.52±0.10c0.31±0.03dc0.83±0.06de2055.80±0.95c12.19±0.89c1.39±0.58c2.01±0.08ab0.37±0.02dc1.01±0.03d3035.73±1.80d9.54±1.03cd1.21±0.11cd1.93±0.05ab0.42±0.01bc1.43±0.02c4020.37±0.73e9.02±0.89cd1.11±0.03cd2.11±0.07ab0.47±0.02b1.67±0.06b5016.57±1.40f8.98±1.90cd1.01±0.09d2.31±0.06a0.57±0.07a1.83±0.05a

由表2可知，堆置過程中，隨時(shí)間延長(zhǎng)，柑橘皮渣水、纖維素、果膠含量顯著減少，而養(yǎng)分含量逐漸增加。其中，柑橘皮渣中的水分隨時(shí)間呈直線降低。在柑橘皮渣堆置降解至第50天，水分含量由74.97%下降到為16.57%，降低了58.4%，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。纖維素含量也明顯降低，30 d后逐步趨于恒定，到50 d，降解率達(dá)到84.45%，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。果膠含量在10 d顯著降低，到30 d時(shí)逐步恒定；到50 d，果膠含量的最低，僅1.01%，降解率達(dá)到65.93%，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。氮磷鉀含量明顯變化。磷和鉀含量持續(xù)增加，氮含量先升高后降低。當(dāng)堆置發(fā)酵至第50天，全氮、P2O5和K2O含量分別為2.31%、0.57%和1.83%，總養(yǎng)分含量（N+P2O5+K2O）為4.71%，大于4.0%，達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2002《有機(jī)肥料》。

2.4 菌株L207和L702的16S rDNA基因序列分析

采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，成功擴(kuò)增出菌株L702和L207的16S rDNA基因，然后對(duì)其進(jìn)行克隆和測(cè)序，測(cè)定菌株L702和L207的序列長(zhǎng)度分別為1 161 bp和840 bp（部分片段）。

圖2 菌株L702（A）和L207（B）的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA gene sequence of strains L702 (A) and L207 (B)

將該序列結(jié)果輸入GenBank，用BLAST進(jìn)行序列同源性分析比較。用DNAMAN中的MegAlign軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）可知，菌株L702與Bacillus licheniformis中的DQgbc4親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到99.20%；菌株L207與Bacillus licheniformis中的E9親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到99.30%。因此初步確定菌株L702和L207均屬于芽孢桿菌屬中的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

3 討 論

皮渣烘干做飼料，具有不產(chǎn)生大量廢液，廢氣，對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，但是柑橘皮渣含水量高，最高可達(dá)70%～80%左右，同時(shí)含有果膠等增加了烘干的難度，烘干需要消耗大量能源。研究表明，烘干1 t鮮皮渣至少需要消耗0.7 t標(biāo)煤[23]，按照2012年標(biāo)煤價(jià)格大約680 元/t計(jì)算，僅標(biāo)煤成本需要476 元，烘干成本高。巴西、美國(guó)等柑橘加工大國(guó)，其能源價(jià)格低，烘干1 t鮮皮渣標(biāo)煤成本不到300元，只是國(guó)內(nèi)標(biāo)煤成本的60%左右[24]；此外國(guó)外柑橘加工生產(chǎn)規(guī)模大，如巴西的Sucocitrico Cutrale公司，年加工規(guī)模達(dá)到150萬 t[5]，具有規(guī)?；膬?yōu)勢(shì)，其處理成本和產(chǎn)出基本相當(dāng)，已被規(guī)?；茝V[25]。但是我國(guó)柑橘加工廠規(guī)模小，年加工5萬 t，只是國(guó)外的1/30，因此，國(guó)內(nèi)柑橘皮渣烘干成本高，產(chǎn)出低，雖然環(huán)保但是并不經(jīng)濟(jì)。

衛(wèi)生填埋投資和運(yùn)行費(fèi)用一般而言相對(duì)較低，操作簡(jiǎn)單易行，目前大多柑橘加工廠采用此方法處理柑橘皮渣。但是柑橘皮渣具有體積大、含水量高，pH值低等特點(diǎn)，進(jìn)行衛(wèi)生填埋處理需要占用大量土地，據(jù)統(tǒng)計(jì)年加工2萬 t的柑橘?gòu)S，將產(chǎn)生1萬 t的柑橘皮渣，通過填埋處理，每年將占地4 000 m2；其次柑橘皮渣含水量高達(dá)70%～80%，填埋處理產(chǎn)生大量的滲漏液，1萬 t皮渣將產(chǎn)生月7 000 t廢水，滲漏液量大，酸度大，化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）高，回收處理難度大，容易對(duì)土壤和水體環(huán)境等造成嚴(yán)重的二次污染；第三，衛(wèi)生填埋是一個(gè)厭氧的不完全降解過程，皮渣的降解耗時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)和氣體等中間產(chǎn)物[26]，污染環(huán)境和空氣，影響周圍人們的生活安全。

柑橘皮渣中含有豐富的香精油，約占果皮鮮質(zhì)量的0.5%～2.0%，研究表明柑橘精油對(duì)大多數(shù)微生物具有廣譜抑制作用。陳林林等[27]研究表明，柑橘精油對(duì)大腸桿菌、白色葡萄球菌和青霉有顯著抑制作用，其最大抑菌濃度均小于3.0%。目前，對(duì)柑橘精油具有較強(qiáng)耐受能力的降解柑橘皮渣的微生物菌群還未見報(bào)道[28]。傳統(tǒng)的堆肥處理是一種有效的皮渣資源化利用的方式，但是由于普通的分解微生物不具有耐柑橘香油和高效的纖維素和果膠分解能力，因此須添加大量的輔料，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%～70%，稀釋了香精油體積分?jǐn)?shù)，減緩香精油對(duì)分解微生物的抑制作用，同時(shí)為微生物快速生長(zhǎng)的提供必要碳源物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)分離獲得的菌株L207和L702對(duì)柑橘香精油具有較好的耐受性，耐受香精油最高體積分?jǐn)?shù)為25.0%，在柑橘皮渣分解實(shí)驗(yàn)中，其輔料添加量?jī)H為20%，柑橘精油體積分?jǐn)?shù)最大約為16%，因此普通微生物生長(zhǎng)受到抑制，但是高效菌株生長(zhǎng)未受影響，其快速生長(zhǎng)有利于皮渣降解，溫度升高，縮短發(fā)酵周期，是柑橘皮渣的降解的重要因素之一。

柑橘皮渣果膠含量高達(dá)20%，果膠與水結(jié)合形成束縛水，使得柑橘皮渣的脫水困難；同時(shí)柑橘皮含有纖維素等大分子物質(zhì)，含量高達(dá)15%，外圍包裹木質(zhì)素層，使得柑橘皮渣難以降解。柑橘皮渣中果膠如不能快速分解，則導(dǎo)致大量水分以束縛水存在，含水量高，氧氣含量低，微生物的分解主要是通過厭氧發(fā)酵進(jìn)行。厭氧發(fā)酵分解效率低，產(chǎn)生的能量少，溫度低，容易發(fā)生腐敗，同時(shí)分解過程中產(chǎn)生大量有機(jī)酸，產(chǎn)生大量臭氣[29]。值得注意的是，在皮渣降解實(shí)驗(yàn)中果膠含量在第10天顯著降低，皮渣束縛水轉(zhuǎn)化為自由水，說明分離獲得的兩株菌株具有高效的果膠降解能力，有利于水分的脫去；果膠分解后微生物的降解主要以好氧分解為主，其分解效率高，釋放大量的熱量，發(fā)酵溫度高，提高微生物相關(guān)酶的活性[30]，既有力于皮渣中果膠、纖維素等大分子物質(zhì)的降解，同時(shí)又縮短發(fā)酵時(shí)間。整個(gè)皮渣發(fā)酵過程持續(xù)約50 d后，皮渣中的纖維素和果膠含量顯著降低，水分含量低于20%，總養(yǎng)分含量大于4%，達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2002。

綜上所述，菌株L207和L702既具有香精油耐受能力，又有較高的纖維素酶和果膠酶活性，能高效分解皮渣，促進(jìn)皮渣脫水，是皮渣降解的關(guān)鍵因素之一，因此可望在柑橘皮渣規(guī)?；幚碇械玫綄?shí)際推廣應(yīng)用。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分離得到2 株降解柑橘皮渣的菌株L207和L702，既具有香精油耐受能力，又有較高的纖維素酶和果膠酶活性。L207和L702的耐受柑橘香精油的最大體積分?jǐn)?shù)為25%；兩株菌株對(duì)柑橘皮渣中的果膠和纖維素有顯著的降解能力，其果膠酶活性是430.27 U和212.32 U，是普通對(duì)照菌株的12.68 倍和7.30 倍；其纖維素酶活性是2.64 U和4.2 U，是普通對(duì)照菌株的1.31 倍和2.08 倍。在柑橘皮渣降解實(shí)驗(yàn)的第20天，纖維素含量由32.30%降到12.19%，降解率達(dá)到84.45%，而果膠含量在第10天由15.32%降到4.22%，降解率達(dá)到65.93%，皮渣中的纖維素和果膠等大分子物質(zhì)大多數(shù)分解。L207和L702菌株經(jīng)16S rDNA基因序列分析鑒定表明均屬于芽孢桿菌屬中的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

[1] 單楊. 中國(guó)柑橘工業(yè)的現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)與對(duì)策[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2008, 8(1): 1-8.

[2] 陸勝民. 世界柑橘生產(chǎn)、貿(mào)易、加工的歷史、現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J].食品與發(fā)酵科技, 2010, 46(6): 63-71.

[3] ROTHSCHILD N, NOYOTNY Y C, VACLAV S. Ligninolytic enzymes of the fungus Irpex lacteus (Polyporus tulipiferae): isolation and characterization of lignin peroxidase[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 31: 627-633.

[4] 孫金輝, 陳海桂, 盧沿鋼, 等. 柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化利用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2011, 32(19): 312-315.

[5] CERISUELO A, CASTELLó L, MOSET V. The inclusion of ensiled citrus pulp in diets for growing pigs: effects on voluntary intake, growth performance, gut microbiology and meat quality[J]. Livestock Science, 2010, 134(1): 180-182.

[6] SUETSUGU T, TANAKA M, IWAI H, et al. Supercritical CO2extraction of essential oil from Kabosu(Citrus sphaerocarpa Tanaka) peel[J]. Flavor, 2013, 2(1): doi: 10.1186/2044-7248-2-18.

[7] MAMMA D, CHRISTAKOPOULOS P. Biotransformation of citrus by-products into value added products[J]. Waste Biomass Valorization, 2013, 7(18): 1-8.

[8] HOSHINO M, TANAKA M, TERADA A, et al. Characteristics of pectin extracted from citrus peel using subcritical water[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 108: S144-S145.

[9] AGU P N, OLUREMI I A, TULEUN C D. Nutrional evaluation of sweet orange fruit peel as a feed resource in broiler production[J]. International Journal of Poultry Science, 2010, 9(7): 684-688.

[10] 關(guān)海寧, 刁小琴, 張潤(rùn)光. 柑橘功能性成分研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J].食品研究與開發(fā), 2008, 29(9): 169-174.

[11] 趙建, 袁玲, 黃建國(guó), 等. 柑橘皮渣高溫堆肥生產(chǎn)有機(jī)肥[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2011, 27(10): 270-276.

[12] 李悅, 侯濱濱, 趙婧. 柑橘類精油抗菌活性的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2011, 32(6): 190-192.

[13] 劉潔麗, 王靖, 李明. 一株纖維素降解細(xì)菌的篩選、鑒定及特性研究[J]. 化學(xué)與生物工程, 2010(4): 54-56.

[14] 蘇騰甲, 朱雄偉, 張佑紅, 等. 一種果膠酶生產(chǎn)菌株的分離及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào), 2012(4): 15-18.

[15] 楊森艷, 姚雷. 檸檬草精油抗性研究[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 12(4): 373-376.

[16] 樊程, 李雙江, 李成磊, 等. 大熊貓腸道纖維素分解菌的分離鑒定及產(chǎn)酶性質(zhì)[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2012(9): 1113-1121.

[17] QB 2583—2003 纖維素酶制劑[S].

[18] 藍(lán)麗精, 周琴, 蔡琪敏, 等. 一株高產(chǎn)果膠酶青霉菌株的篩選鑒定[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2011, 11(4): 452-456.

[19] 吳丹, 鄧澤元, 范亞葦, 等. 一株纖維素分解菌的分離、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(6): 218-221.

[20] 楊劍虹, 王成林, 代亨林. 土壤農(nóng)化分析與環(huán)境監(jiān)測(cè)[M]. 北京: 中國(guó)大地出版社, 2005: 242-267.

[21] van SOEST P J. Development of a comprehensive system of feed analyses and its application to for ages[J]. Journal of Dairy Science, 1967, 26(1): 119-128.

[22] 尚雪波, 帥鳴. 柑橘皮渣中果膠含量的測(cè)定[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(9): 88-90.

[23] 李赤翎, 李彥, 俞建, 等. 柑橘皮渣發(fā)酵飼料研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(5): 169-174.

[24] 鐘良琴. 柑橘渣的飼用價(jià)值研究[J]. 資源開發(fā)與利用, 2009(7): 74-77.

[25] CHENG Gong, LI Fengcheng, XUE Xiangfan. Suggestions on the orange-processing technologes of Brazil and Spain[J]. Modern Food Science and Technology, 2010, 26(2): 195-197.

[26] 胡新軍, 張敏, 余俊峰, 等. 中國(guó)餐廚垃圾處理的現(xiàn)狀、問題和對(duì)策[J].生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 32(14): 4575-4584.

[27] 陳林林, 米強(qiáng), 辛嘉英. 柑橘皮精油成分分析及抑菌活性研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(17): 25-28.

[28] 趙紅, 張衍林. 腐爛柑橘與豬糞混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣試驗(yàn)研究[J].中國(guó)沼氣, 2011, 29(2): 19-24.

[29] 韓捷, 向欣, 程紅勝, 等. 好氧預(yù)處理對(duì)干法沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響及能量損失[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2011, 27(12): 246-249.

[30] 王得武, 姚拓, 楊巧麗, 等. 高效木質(zhì)纖維素分解菌群篩選及其酸堿調(diào)節(jié)能力研究[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 21(5): 621-627.

Screening of Two Bacterial Strains Capable of Degrading Citrus Pomace and Their Characteristics

LI Shi-zhong1, HUANG Jian-guo1, LI Zhi-ling1, PENG Liang-zhi2, LI Yong1,*
(1. College of Resources and Environment, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400715, China)

This study was conducted to screen microorganisms degrading citrus pomace. Five strains of citrus pomacedegrading bacteria were screened from soil compost and tested for citrus essential oil toleranc. Two of these strains were found to have higher tolerance. Meanwhile, cellulase and pectinase activities of the two selected strains were also determined, and their ability to degrade citrus pomace was characterized. The experimental results showed that the selected strains L207 and L702 could grow normally at 65 ℃ as thermophilic stains. They could tolerate up to 25.0% aqueous ethanol and produce 1.31 and 2.08 times higher cellulase activity, and 12.68 and 7.30 times higher pectinase activity than the control Bacillus subtilis L520, respectively. Both strains were able to rapidly and efficiently degrade cellulose and pectin. 16S rDNA sequencing showed that they both belonged to Bacillus licheniformis.

citrus pomace degrading bacteria; citrus essential oil; cellulase; pectinase; 16S rDNA

Q939.96

A

1002-6630（2014）23-0188-05

10.7506/spkx1002-6630-201423037

2013-12-24

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2013GB2F100396）；重慶市重大科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 （cstc2012gg-yyjsB80007）；西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目（SWU113018）

李世忠（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)及有機(jī)污染物處理。E-mail：lsz_137400@126.com

*通信作者：李勇（1974—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)微生物和環(huán)境微生物學(xué)。E-mail：liyongwf@swu.edu.cn