張志勇，曾文興，胡有長，何媛，施橋發(fā)，王美珍

(1、江西省人民醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；2、宜春市人民醫(yī)院檢驗科，江西宜春336000；3、九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，江西九江332000；4、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330006)

·調(diào)查報告·

1610例HPV患者亞型感染調(diào)查分析

張志勇1，曾文興2，胡有長4，何媛3，施橋發(fā)4，王美珍4

(1、江西省人民醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；2、宜春市人民醫(yī)院檢驗科，江西宜春336000；3、九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，江西九江332000；4、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330006)

目的了解人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染亞型在人群中的分布情況。方法采用PCR-反向點雜交法對本院就診者HPV基因分型檢測。結(jié)果在1610例樣本中，檢測出就診人群HPV陽性率28.82%，女性陽性率29.14%、男性陽性率24%；在HPV感染類型中，高危型占構(gòu)成比的71.02%，其中女性占70.38%，男性占0.64%；低危型占構(gòu)成比的15.28%，其中女性占10.82%，男性占4.46%；常見型構(gòu)成比占13.68%，其中女性占13.37%、男性占0.31%。在多重感染中，就診者或女性都主要以高危亞型為主、占43.33%，而男性主要以低危亞型為主、占5.00%，并以25歲以下人群HPV感染陽性率最高、占40.38%。結(jié)論在HPV感染人群中，單一感染或多重感染都以高危型最常見；在多重感染(雙重感染為主)中，人群或女性都以高危型常見，男性以低危型多見，而以25歲以下人群最多見，主要由高危亞型構(gòu)成的混合感染。

HPV；亞型；PCR-反向點雜交

隨著醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展，人們對HPV亞型的認(rèn)定已多達(dá)130多種；部分可通過生殖道和性接觸感染傳播，引起男性生殖器疣及前列腺癌、陰莖癌及女性肛門癌、宮頸癌、乳腺癌等感染相關(guān)惡性腫瘤[1]；HPV在男女性感染后最初主要以亞臨床感染為主，導(dǎo)致在人群中存在著大量的無癥狀病毒攜帶者，增加了人群感染的危險性。由于各地區(qū)HPV人群感染率和亞型的分布均存在差異[2-4]，而不同HPV亞型其治療方式和疾病的種類不同[5]，因此了解本地區(qū)HPV亞型感染分布情況，對生殖器感染早發(fā)現(xiàn)及防治有重要作用[6]。本文通過收集本院從2011年1月至2013年1月1610例門診就診者的拭子，通過以PCR為基礎(chǔ)的DNA反向點雜交技術(shù)對HPV-DNA檢測及分型。

1 材料與方法

1.1 研究對象2011年6月到2013年6月1610名男女就診者，年齡段為18～72歲，平均38.5±10.8歲。

1.2 儀器及材料DA7600核酸擴(kuò)增分析儀，核酸導(dǎo)流快速雜交儀，DNA提取試劑和HPV擴(kuò)增試劑，導(dǎo)流快速雜交試劑(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 標(biāo)本收集利用拭子收集男性尿道內(nèi)分泌物及女性宮頸脫落細(xì)胞。

1.3.2 標(biāo)本處理轉(zhuǎn)動棉試子，將棉試子上的細(xì)胞洗脫于1ml生理鹽水中，擠干棉拭子。脫液轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，10000r/min離心5min。棄上清，沉淀加入50μl DNA提取液充分混勻，100℃保溫10min。10000r/min離心5min，上清備用。

1.3.3 PCR擴(kuò)增取PCR反應(yīng)管若干，分別加入提取上清5μl，6000r/min瞬時離心后，將各反應(yīng)管放入PCR儀，按照試劑盒說明書擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.4 PCR-反向點雜交法過程將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物98℃，8 min變性，立即置于冰水混合物上2min。將膜條放入5ml離心管中，加入4ml預(yù)熱雜交液I。將變性后的PCR產(chǎn)物加入到離心管中，放置45℃恒溫水浴箱中雜交50min。棄雜交液I，將膜條取出，放入50ml離心管中，然后加入20ml雜交液Ⅱ，放置45℃恒溫水浴箱中水浴10min，重復(fù)2次。棄雜交液Ⅱ，加入20ml結(jié)合液，放置于20～30℃水浴箱中，避光(用黑色塑料薄膜包好離心管)反應(yīng)10min。棄結(jié)合液，加入20～30℃雜交液I，混勻3min后棄去，重復(fù)2次。棄雜交液I，20ml溶液Ⅱ，混勻3min。棄溶液Ⅱ，加入已配好的顯色液20ml，避光反應(yīng)5～10min。顯色反應(yīng)結(jié)束后，立即棄去顯色液，加入20ml溶液Ⅱ，混勻3min，然后棄去溶液Ⅱ，加入20ml蒸餾水，輕搖3min后取出，用吸水紙吸去膜條表面水份，盡快觀察結(jié)果。

1.3.5 結(jié)果判斷肉眼觀察檢測結(jié)果，陽性結(jié)果為藍(lán)紫色圓點，根據(jù)雜交膜上探針分布的位置，判斷陽性點為何種HPV基因型，多個圓點即為多重感染。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法結(jié)果應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件,采用卡方檢驗，以P=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 HPV亞型感染分布在1610例門診就診者中共檢出464例陽性，陽性率為28.82%，女性陽性率29.14%，男性陽性率24%。單一型陽性有344例，占HPV感染陽性構(gòu)成比74.1%。在檢出的628例HPV陽性標(biāo)本構(gòu)成比中，高危型占71.02%，女性70.38%、男性0.64%；低危型占15.28%、女性占10.82%、男性4.46%；常見型占13.68%、女性13.37%、男性0.31%。從HPV亞型分布看，人群中前5位是HPV16、58、52、11、53型；其中女性前5位是HPV16、58、52、53、11型；男性前五位是HPV11、6、16、33、53型，其它亞型未檢出，如表1所示。

表1 HPV亞型感染分布情況[n(%)]

2.2 HPV多重感染情況在464例HPV陽性患者中，多重感染有120例，占HPV感染陽性構(gòu)成比25.9%。在多重感染類型中，都以雙重感染在混合感染的構(gòu)成比最高。在多重感染構(gòu)成中，其中全部就診者或女性都以高危混合型構(gòu)成比最高，占43.33%，而男性則以低?；旌闲妥罡?，占5%，如表2所示。

2.3 HPV感染年齡分布在被檢測的1610例人群中，年齡最大72歲，最小18歲，平均年齡38.5歲，共檢出HPV陽性464例，在各年齡段分布有所不同，其中HPV感染陽性率最高主要分布在25歲以下人群，占40.38%，以混合感染(47.62%)或高危亞型感染(38.1%)為主，而其它年齡段HPV感染亞型以高危型為主，如表3所示。

3 討論

HPV在人群中存在普遍感染，具有科屬特異性，不同HPV亞型編碼外殼蛋白的基因突變很大，且不同亞型之間基本沒有交叉保護(hù)性抗體，易發(fā)生HPV不同亞型多重感染，導(dǎo)致許多良惡性疾病的誘發(fā)，而據(jù)Lee[7]等研究宮頸癌發(fā)現(xiàn)單一和多重HPV感染使宮頸癌的風(fēng)險分別增加19.9和31.8倍，多重感染與生殖器病變呈正相關(guān)[8]。根據(jù)感染后病變情況可將其分為與宮頸癌、外陰癌等生殖器惡性腫瘤相關(guān)的高危型[9,10]，與生殖器疣樣病變及宮頸良性病變相關(guān)的低危型[7,11]，以及中國常見型[12]。

在我國，人口和地域面積都在世界排前，各地區(qū)生活水平及環(huán)境不同，HPV亞型與分布復(fù)雜多變，本研究對1610例門診就診者進(jìn)行觀察，共檢測出464例陽性患者，陽性率為28.82%，其中女性感染率29.14%，明顯高于王文強(qiáng)[13]、徐維[14]報導(dǎo)，低于國外報導(dǎo)的59%。而男性陽性率24%，高于唐旭[15]HPV-DNA陽性率報導(dǎo)，低于美國STD門診男性HPV感染率為28.2%[16]，丹麥為45%～49%[17]。在HPV感染類型中，說明本地區(qū)人群、特別女性中感染HPV高危型常見，而男性以低危型常見?？赡芘c不同種族、不同地域及主動來醫(yī)院就診的疑似HPV感染者及檢測技術(shù)等有關(guān)。

而在本研究報道人群或女性中HPV感染亞型的前三位都是HPV16、58和52型，長江以北以HPV58、52占第2、3位報道一致，而與長江以南以HPV18、58占第2、3位報道不同，但HPV16與我國南北方調(diào)查顯示HPV16型感染率最高，并在宮頸病變中的感染率都居第一位報道相同。HPV16是最難清除掉的基因型，也是混合型中較常見的，多重基因型感染相比單一基因型更難清除，而男性主要以HPV11、6和16型感染為主。不同性別人群HPV感染亞型不同，分析其可能是與個人衛(wèi)生情況及性行為、人體生理解剖結(jié)構(gòu)等是造成不同地區(qū)人群及性別HPV感染率和亞型不同的主要影響因素。

表2 HPV多重感染情況[n(%)]

表3 HPV感染人群年齡段分布

Bachtiar B等[18]發(fā)現(xiàn)多重感染的患者對放療的敏感性較差，并且無進(jìn)展生存期和帶瘤生存期均比單一感染的人顯著縮短。本文研究中發(fā)現(xiàn)，在464例陽性患者中，HPV多重感染120例，占HPV感染率25.9%、其中女性比男性多見，但男女多重感染率之間無明顯差異，都是以雙重感染多見。但在多重感染構(gòu)成比中，女性由HPV16、58、52高危亞型組成的雙重感染或形成混合型感染為主要形式，并以25歲以下年齡段人群為主要感染對象，表明HPV感染率隨年齡增長呈負(fù)相關(guān)，可能對病毒的免疫反應(yīng)型別之間存在差異[19]，因此中青年人群是HPV主要感染主要對象，并以高危型引起的多重感染為主，說明高危亞型在女性宮頸癌發(fā)病率中有重要風(fēng)險，且癌癥發(fā)展需多年(平均12±2.9年)后由一個量變到質(zhì)變、漸變到突變過程最終后果，主要發(fā)病高峰于50歲左右，而男性主要由HPV11、6低危型組成，也有高危型。低危型主要引起男性尖銳濕疣，與楊培謙報道一致[11]，好發(fā)于20～35歲中青年，因該年齡段性生活活躍，且該病漸年輕化。高危型與Hussain SK等報道男性引起男性陰莖癌、肛門癌等大部分由HPV引起[10，11，13，16,17,20]，幾乎都與HPV16、18高危型有關(guān)，而這兩型也是導(dǎo)致宮頸癌的常見亞型[5,11]。分析其可能主要是性傳播，有多個性伴侶的男性被認(rèn)為是“高危型男”[16]，而該行為狀態(tài)隨著年齡的增大而逐步減弱，HPV的流行狀態(tài)也逐漸降低[21]，進(jìn)入老齡階段后，人體免疫力大幅度降低，機(jī)體清除病毒的功能下降，更容易感染，或者釋放被抑制的HPV病毒，導(dǎo)致發(fā)生癌前病變的機(jī)會加大[10]?？赏ㄟ^性接觸感染HPV后，主要以亞臨床癥狀為主，并傳給其他伴侶，所以成為女性感染的傳染源[17，22]，故因積極采取相關(guān)措施防范這一感染源。因此HPV感染在男性也普遍，對女性宮頸癌的發(fā)生起重要作用，需早期檢測是預(yù)防和診療的絕好時機(jī)[23]。

目前HPV疫苗主要對HPV(16/18/6/11)亞型有預(yù)防作用，并主要通過組織學(xué)、免疫學(xué)等技術(shù)通過檢測，對陽性患者進(jìn)行采取相關(guān)治療措施，但不能確定HPV基因型別。而HPV-DNA雜交操作簡便[5]，因此，采用基于核酸雜交和基于PCR技術(shù)的方法，針對本地區(qū)HPV感染率高的亞型，采取有效措施。

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R7377，R373.9，R446.62

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1674-1129(2014)04-0469-04

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2014-03-03；

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江西省衛(wèi)生廳科技計劃項目(編號：20092025、20092026)。

王美珍。