甘潔民，繆應(yīng)新，張蓉，施泓

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院，上海200040)

電化學(xué)發(fā)光測定血清總Ⅰ型前膠原氨基端前肽的分析性能評價

甘潔民，繆應(yīng)新，張蓉，施泓

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院，上海200040)

目的按美國病理家學(xué)會(CAP)的要求，驗證電化學(xué)發(fā)光免疫測定人血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)的各項分析性能，建立本實驗室的參考范圍。方法選取低值和高值2個水平的質(zhì)控品，每天檢測一次，連續(xù)20次，統(tǒng)計日間變異；用6種不同濃度的低值血清連續(xù)檢測10d,檢測功能靈敏度；將高值和低值血清按一定比例混合，檢測其濃度，回歸分析驗證測量范圍；選取138名健康體檢人群檢測tP1NP，建立本實驗室的參考范圍。結(jié)果日間CV分別4.7%和2.4%；功能靈敏度為6.60ng/ml;分析驗證測量范圍(AMR)在6.8～1020.2ng/ml;本實驗室tP1NP的參考范圍為17.8～55.8ml。結(jié)論用電化學(xué)發(fā)光免疫法測定血清I型前膠原氨基端前肽，靈敏度高，穩(wěn)定性好,本系統(tǒng)的各項性能符合CAP要求。

血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)；電化學(xué)發(fā)光免疫；方法學(xué)評價

Ⅰ型膠原是骨的重要蛋白，是骨有機(jī)質(zhì)的主要成分，約占骨基質(zhì)的90%，由兩條α1鏈及一條α2鏈構(gòu)成的異三聚體，其中編碼α1鏈基因為COLIA1，α2鏈為COLIA2，兩種多肽鏈以2：1合成。

Ⅰ型前膠原氨基端前肽(N-terminal propeptide of typeⅠprocollagen，tP1NP)是從1型前膠原分子的兩端分解出來的前膠原肽，Ⅰ型前膠原是Ⅰ型膠原前體，Ⅰ型前膠原經(jīng)蛋白酶水解作用，從Ⅰ型前膠原分子的兩端分解出兩個前膠原肽，即為tP1NP和PICP(procollagen type I C-terminal propeptide,Ⅰ型前膠原羧基端前肽)，它們是沉集于基質(zhì)之前所釋放出的物質(zhì)，是各自從未成熟膠原釋放的(在Ⅰ型膠原合成增殖期)，兩者可反映Ⅰ型膠原形成速率。當(dāng)成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)時，前膠原合成增多，tP1NP在血液中濃度增高[1]。目前國內(nèi)大多用酶聯(lián)免疫法測定，本文采用羅氏公司近幾年推出的產(chǎn)品測定血清tP1NP，并作初步的臨床評價。

為了提高檢驗質(zhì)量，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)頒布了《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的專用要求》(ISO15189)作為醫(yī)學(xué)實驗室認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，要求申請認(rèn)可的實驗室應(yīng)對檢測系統(tǒng)和方法的主要分析性能進(jìn)行驗證或確認(rèn)[2]，證實其能夠達(dá)到所要求的性能標(biāo)準(zhǔn)。另外美國病理家學(xué)會(CAP)也要求申請認(rèn)可的實驗室，在開展某一檢測項目前，必須對檢測系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)評價和建立本實驗室的參考區(qū)間，因此本文對羅氏Elecsys2010系統(tǒng)進(jìn)行TP1NP檢測的方法學(xué)評價，并對138例健康體檢者進(jìn)行tP1NP的檢測，建立本實驗室的參考范圍。

1 材料與方法

1.1 對象對照組：138例，年齡30～70歲，體格檢查均無肝腎及內(nèi)分泌疾患及其他骨礦代謝性疾病，未服用影響骨礦代謝的藥物。其中男性70例，女性68例。所有入選人群腰椎和髖部骨密度BMD T-score＞-2.5。疾病組：均系明確診斷為各種疾病的本院住院患者187例，其中骨質(zhì)疏松癥組：123例，年齡40～78歲腰椎或髖部骨密度BMD T-score＜-2.5；甲狀腺功能亢進(jìn)組:22例，年齡35～70歲；腎功能不全組:22例，年齡40～69歲；腫瘤骨轉(zhuǎn)移組:9例，年齡42～68歲；變形性骨炎組：1例，年齡68歲；肝纖維化組：10例，年齡40～78歲。上述對象用含促凝劑的真空采血管采血3ml,3h內(nèi)離心，直接上機(jī)檢測。

1.2 試劑和儀器電化學(xué)發(fā)光免疫法測定血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)，儀器為羅氏公司Elecsys2010全自動免疫測定儀，試劑由羅氏公司配套提供。

1.3 方法

1.3.1 電化學(xué)發(fā)光免疫法，其原理是雙抗體夾心法待測樣品中的血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)、釕標(biāo)記的單克隆tP1NP抗體和包被抗體的磁性微珠充分反應(yīng)，形成釕-抗體-抗原-抗體-微珠復(fù)合物。被磁性微珠捕獲的釕在磁鐵的作用下被吸附，並被激發(fā)電壓激發(fā)，發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最后產(chǎn)生的光強(qiáng)度與釕的濃度呈線性關(guān)系，據(jù)此測出血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)的含量。

1.3.2 分析性能驗證(1)精密度驗證：選取低值(批號：178227，濃度：75.4ng/ml)和高值(批號：178227，濃度：704ng/ml)2個水平的質(zhì)控品，每天檢測一次，連續(xù)20次，然后計算檢測結(jié)果的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。(2)準(zhǔn)確度驗證：用批號為178226-01的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)監(jiān)測系統(tǒng)后，再對同一批號和不同批號的校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與各自的靶值進(jìn)行比對。(3)功能靈敏度確認(rèn)：選擇不同濃度的低值血清6份，連續(xù)10d各檢測1次樣品，計算各份血清的，計算各份血清的x﹑s和CV，以CV為20%時所對應(yīng)的濃度為該檢測系統(tǒng)的功能靈敏度。(4)分析測量范圍驗證：取高值和低值血清各一份，并按高值：低值3：1﹑2：2﹑1：3的比例混合成不同濃度的血清3份，將這5份血清分別檢測4次tP1NP，以理論值與測試值作回歸分析。

1.3.3 統(tǒng)計方法采用SPSS軟件，所有數(shù)據(jù)采用x±s表示，用t值檢驗比較各組差異。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗2個水平配套控制品每天檢測一次，連續(xù)20次，日間CV分別4.7%和2.4%(表1)。

表1 精密度實驗結(jié)果(ng/ml)

2.2 準(zhǔn)確度試驗2個批號校準(zhǔn)品的驗證值與靶值的偏倚在1.4%～5.2%范圍，達(dá)到國際公認(rèn)的質(zhì)量要求(允許偏差11.9%)。

2.3 功能靈敏度濃度為13.26﹑11.18﹑9.32﹑8.46﹑7.49﹑6.62 ng/ml樣品的CV分別4.14%﹑7.25%﹑10.12%﹑13.26%﹑17.09%﹑20.08%,CV在20%時對應(yīng)的tP1NP濃度為6.62ng/ml，為tP1NP檢測的功能靈敏度。

2.4 分析測量范圍理論值為1202.2﹑903.4﹑604.5﹑320.9和6.8ng/ml的樣品，其檢測值分別為1202.2﹑872.3﹑591.8﹑308.5和6.8ng/ml,回歸方程為Y=0.990X-7.354,r2=0.999。按b=1.00±0.05,r＞0.975為判斷標(biāo)準(zhǔn)，本次評估符合要求，本檢測系統(tǒng)的AMR在6.8～1020.2ng/ml。

2.5 參考區(qū)間實驗結(jié)果(ng/ml)tP1NP的參考區(qū)間為36.8±9.7，以x±1.96s為95%的數(shù)據(jù)范圍，則參考區(qū)間為17.8～55.8 ng/ml。

2.6 各疾病組血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)測定值各疾病組與對照組比均有顯著差異。升高最明顯的是異位甲狀旁腺腺瘤，與其它各疾病組有非常顯著的差異。其次是甲亢組，與其它各疾病組有非常顯著的差異。見表2。

表2 各疾病組血清I型前膠原氨基端前肽(P1NP)測定值

3 討論

美國病理家學(xué)會(CAP)要求申請認(rèn)可的實驗室，在開展某一檢測項目前，必須對檢測系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)評價和建立本實驗室的參考區(qū)間，我國2006年頒布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實驗室管理辦法》要求，對未開展室間質(zhì)評的檢測項目，必須對檢測系統(tǒng)的分析性能進(jìn)行評價，才可將分析系統(tǒng)用于常規(guī)工作。本研究對羅氏Elecsys2010電化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)測定人血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)的各項分析性能系統(tǒng)進(jìn)行驗證，旨在建立一套相對簡便易行的，適合電化學(xué)發(fā)光免疫方法學(xué)評價的驗證方法。

膠原蛋白是人體主要蛋白成分，約占人體總蛋白的25%，是構(gòu)成膠原纖維的基本單位，膠原纖維是細(xì)胞間質(zhì)的主要成分，膠原纖維在器官、結(jié)締組織中分布最廣?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)十來種不同型膠原蛋白分子，其中與骨代謝有關(guān)的有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等膠原蛋白。膠原蛋白在中性條件下不易分解，但在合成膠原的過程中以前膠原的形式分泌出細(xì)胞外，經(jīng)內(nèi)切酶作用后，前膠原釋放出羧基端和氨基端前肽，轉(zhuǎn)化成膠原分子，再相互交聯(lián)成膠原纖維，膠原纖維的連結(jié)是靠疏水作用和靜電引力，在膠原基質(zhì)的成熟時期，膠原蛋白可遭到降解，在體液中可出現(xiàn)游離和結(jié)合的交聯(lián)物，交叉聯(lián)合終肽，前肽，氨基酸等代謝產(chǎn)物。女性在絕經(jīng)后，由于雌激素水平迅速降低，骨轉(zhuǎn)換率升高，骨吸收顯著增加的同時成骨細(xì)胞的數(shù)量和功能增加，血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)是各自從未成熟膠原釋放的(在Ⅰ型膠原合成增殖期)，可反映Ⅰ型膠原形成速率。當(dāng)成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)時，前膠原合成增多，tP1NP在血液中濃度增高。目前用來評價骨形成的主要生化指標(biāo)是N-MIN骨鈣素、骨堿性磷酸酶等，兩者都有其局限性，前者受腎功能和藥物影響較大[3]，后者易與肝源性堿性磷酸酶發(fā)生交叉反應(yīng)。tP1NP在人體內(nèi)較日間變異較小[4]，tP1NP分子量大，不能由腎臟過濾清除，而由肝臟代謝，所以受肝功能影響,肝纖維化病人血清tP1NP升高,在臨床評價時要引起注意。

各種骨代謝疾病，由于骨轉(zhuǎn)換率不同，骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)有不同程度的升高，這些骨代謝疾病往往會導(dǎo)致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松[5]。目前國內(nèi)較多采用酶聯(lián)免疫法測定血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)，本文應(yīng)用先進(jìn)的電化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)(ECLIA)自動測定血清I型前膠原氨基端前肽(tP1NP)，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好[6]，可克服上述缺點，能很好地反映骨轉(zhuǎn)換的變化[7]，是骨代謝疾病研究的診斷、監(jiān)測、治療效果觀察非常有價值的指標(biāo)。

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Evaluation of a automated electrochemiluminescence system for serum total N-terminal propeptide of type I collagen as-say

Objective To evaluate automated electrochemiluminescence system for assay of serum total N-terminal propeptide of type I collagen(tP1NP)and establish the reference value in our laboratory.Methods Serum tP1NP was measured on Elecsys 2010 automated analyzer(Roche).The between-run coefficient of variation(CV)was calculated with the tested values of high and low lever controls.The functional sensitivity was analyzed with a series tested results of low lever serum.The analytic measurement range(AMR)was determined with the results of mixed serum.The reference range of serum tP1NP in our laboratory was established with the detected results of 138 normal subjects.Results The between-run CVs were 4.7%and 2.4%.The functional sensitivity was 6.60 ng/ml.AMR was 6.8～1020.2ng/ml.The reference range was 17.8～55.8 ng/ml.Conclusion The ECLIA method has good performance for detecting tP1NP level.

N-terminal propeptide of typeⅠprocollagen(tP1NP)；Electrochemiluminescence;Evaluation of method

R446.62

A

1674-1129(2014)04-0389-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.04.008

GAN Jiemin,MIAO Yingxing,ZHANG Rong,et al.
Huadong Hosptial,Fudan University,Shanghai 200040,China.

2014-03-25；

2014-06-03)

甘潔民，女，1964年6月生，副主任技師，生化免疫專業(yè)，研究方向為骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物、腫瘤標(biāo)志物等。