錢榕，方昌志，熊麗紅，楊莉娜

(江西省血液中心，江西南昌330077)

·實(shí)驗(yàn)研究·

南昌地區(qū)獻(xiàn)血者HBV感染隱匿風(fēng)險(xiǎn)與基因型調(diào)查分析

錢榕，方昌志，熊麗紅，楊莉娜

(江西省血液中心，江西南昌330077)

目的探討南昌地區(qū)獻(xiàn)血者乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染隱匿風(fēng)險(xiǎn)與HBV感染人群中HBV基因分型，為血液篩查策略、地區(qū)流行病學(xué)提供研究數(shù)據(jù)。方法(1)對(duì)2012年1月1日至2012年12月31日64 400份獻(xiàn)血者標(biāo)本采用ELISA法進(jìn)行HBsAg篩檢；(2)對(duì)HBsAg篩檢陰性標(biāo)本進(jìn)行HBV/HCV/HIV 3項(xiàng)聯(lián)合病毒核酸檢測(cè)(Nucleic Acid Amplification Testing,NAT)，再對(duì)NAT陽性標(biāo)本進(jìn)行HBV DNA定量及血清乙肝五項(xiàng)標(biāo)志物檢測(cè)；(3)選取HBsAg篩查陽性標(biāo)本200份和HBsAg篩查陰性而HBV DNA陽性標(biāo)本30份，對(duì)所有HBV DNA陽性標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸提取、擴(kuò)增及測(cè)序分型，檢測(cè)HBV基因型。結(jié)果(1)64 400份獻(xiàn)血者標(biāo)本中共檢出HBsAg陽性862份和陰性63538份；HBsAg檢測(cè)陰性標(biāo)本通過NAT檢測(cè)，共檢出HBV DNA陽性84份，獻(xiàn)血者HBV感染率為1.47%，HBV輸血感染隱匿風(fēng)險(xiǎn)為0.13%；(2)獻(xiàn)血者HBV感染以隱匿型為主(75.0%，63/84)，其病毒載量多數(shù)＜20/ml(70.2%，59/84)；3)選取的200份HBsAg陽性標(biāo)本中共檢出HBV DNA陽性118份，148份HBV DNA陽性標(biāo)本有66份樣本分型成功，共檢出B基因型為47份(71.2%)，C基因型為19份(28.8%)，未檢出其它基因型。結(jié)論ELISA法篩查HBsAg陰性的獻(xiàn)血者中HBV感染隱匿風(fēng)險(xiǎn)依然存在，且多以低病毒載量的隱匿性感染為主，應(yīng)對(duì)獻(xiàn)血者標(biāo)本常規(guī)開展NAT檢測(cè)；南昌地區(qū)獻(xiàn)血者中HBV感染基因型以B型為主，C型次之，未見其它基因型。

獻(xiàn)血者；HBsAg；基因型；核酸檢測(cè)；風(fēng)險(xiǎn)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染可致人體出現(xiàn)急性、慢性肝炎、肝硬化等疾病，能通過輸血傳播，屬血液傳播性疾病。我國對(duì)獻(xiàn)血者HBV感染篩查主要通過ELISA法檢測(cè)HBsAg，但由于病毒感染窗口期、隱匿性肝炎(Occult HBV Infection,OBI)、基因變異等因素的存在，少數(shù)HB-sAg篩查陰性的獻(xiàn)血者體內(nèi)仍有存在一定程度HBV DNA復(fù)制的可能，ELISA法篩查HBsAg存在一定的局限性，因此，需要通過病毒核酸檢測(cè)技術(shù)(Nucleic Acid Amplification Testing,NAT)對(duì)獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)來降低HBV輸血感染隱匿風(fēng)險(xiǎn)，提高輸血安全性[1-5]。本研究通過對(duì)2012年南昌地區(qū)獻(xiàn)血者標(biāo)本的HBV感染檢測(cè)，分析了本地區(qū)獻(xiàn)血者HBV感染率及HBV輸血感染的隱匿風(fēng)險(xiǎn)，并探討了獻(xiàn)血者HBV感染基因型分布情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源與處理本中心2012年1月1日至2012年12月31日HBsAg試紙快篩合格的無償獻(xiàn)血者64 400名，獻(xiàn)血后均留取血液標(biāo)本3管：2管為帶分離膠EDTA抗凝真空采血管，每管血樣5 ml，其中1管用于NAT檢測(cè)，另1管用于HBV分型檢測(cè)；1管為EDTA抗凝真空采血管，血樣5 mL，用于HBsAg檢測(cè)；所有標(biāo)本經(jīng)3 000 g×15min離心后，HBV分型樣本置-20℃凍存，其余標(biāo)本均保存于2～8℃冰箱。

1.2 儀器與試劑Hamilton Microlab Star全自動(dòng)加樣儀(瑞士哈密頓公司)；XANTUS全自動(dòng)加樣儀(深圳愛康電子有限公司)；FAME全自動(dòng)酶免分析儀(瑞士哈密頓公司)；Cobas s201(瑞士羅氏公司)；AB3500XI測(cè)序儀(美國ABI公司)；HBsAg金標(biāo)快篩試劑(廈門新創(chuàng))，HBsAg ELISA檢測(cè)試劑(廈門新創(chuàng)和北京金豪)，核酸定性篩查試劑：Cobas TaqScreen MPX Test 1.0(瑞士羅氏診斷公司)；核酸定量檢測(cè)試劑：COBASRAmpliPrep/COBASRTaq-Man HBV Test2.0(瑞士羅氏診斷公司)；DNA提取試劑：QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司)；所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 檢測(cè)流程

1.3.1 HBsAg試紙快篩檢測(cè)獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血前采用金標(biāo)快篩試劑進(jìn)行HBsAg檢測(cè)，對(duì)金標(biāo)法HBsAg檢測(cè)結(jié)果合格的獻(xiàn)血者，按要求采集和保存血液標(biāo)本。

1.3.2 HBsAg ELISA檢測(cè)所有獻(xiàn)血者標(biāo)本同時(shí)選用兩種不同廠家試劑采用ELISA法進(jìn)行HBsAg檢測(cè)，對(duì)HBsAg篩檢陰性標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。判定規(guī)則：每板設(shè)置陰性與弱陽性質(zhì)控各一孔，室內(nèi)質(zhì)控在控則判定本批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效；酶免檢測(cè)S/CO≥1判為有反應(yīng)性，S/CO值在0.8～1之間設(shè)置為灰區(qū)；雙試劑檢測(cè)均為S/CO≥0.8判定為不合格，如僅單試劑檢測(cè)S/CO≥0.8，采用同種試劑對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行雙孔復(fù)檢，任1孔S/CO≥0.8判為不合格。

1.3.3 病毒核酸檢測(cè)采用Cobas TaqScreen MPX 1.0試劑對(duì)陰性血液標(biāo)本進(jìn)行HBV/HCV/HIV 3項(xiàng)NAT檢測(cè)，檢測(cè)模式為混樣檢測(cè)+拆分檢測(cè)，先將6份標(biāo)本(167μl/份)匯集為1份混樣標(biāo)本(1ml)，在Cobas s201血液核酸篩查平臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)，如混樣檢測(cè)結(jié)果為陰性，則該6份標(biāo)本NAT檢測(cè)陰性，如混樣檢測(cè)結(jié)果為陽性，則該6份標(biāo)本進(jìn)行單標(biāo)本拆分檢測(cè)(1ml/份)，如單標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陰性，則該份標(biāo)本3項(xiàng)NAT聯(lián)合檢測(cè)陰性，反之，則該單份標(biāo)本3項(xiàng)聯(lián)合NAT檢測(cè)陽性。所有NAT陽性標(biāo)本進(jìn)行HBV DNA定量檢測(cè)，未檢出HBV DNA，則HBV DNA檢測(cè)陰性，反之，則HBV DNA檢測(cè)陽性。

1.3.4 血清乙肝標(biāo)志物檢測(cè)HBV DNA陽性樣本采用Roche ELECSYS2010全自動(dòng)免疫電化學(xué)發(fā)光分析儀配套試劑進(jìn)行乙肝五項(xiàng)血清標(biāo)志物檢測(cè)。

1.3.5 HBV測(cè)序分型(1)HBV DNA定量檢測(cè)：選取200份HBsAg陽性標(biāo)本采用單人份檢測(cè)模式進(jìn)行HBV DNA定量檢測(cè)：分別吸取650μl標(biāo)本在COBASRAmpliPrep/COBASRTaqMan平臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè)，未檢出HBV DNA,則該標(biāo)本HBV DNA陰性，檢出HBV DNA,則直接報(bào)HBV DNA定量結(jié)果。(2) HBV DNA陽性樣本序列分析用QIAamp DNA blood mini kit從HBV DNA陽性標(biāo)本中提取HBV DNA，按試劑說明書操作，最后以50μl水溶解，A260/280值為1.8～2.1，通過分析比較GENBANK中已公布的已知基因型的HBV S區(qū)序列，根據(jù)其保守區(qū)域設(shè)計(jì)出4條引物(表1)，用于該序列的巢式PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)體系:10×buffer2.0μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，dNTP0.8μl，Taq酶0.2μl，ddH2O 11.2μl，模板5.0μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2min、94℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸3min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。2輪PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件相同。擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定:PCR結(jié)束后取產(chǎn)物5μl，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。用DL2000作為Marker判斷產(chǎn)物分子量大小。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后用第2輪擴(kuò)增引物作為測(cè)序引物做雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用ClustalⅩ與標(biāo)準(zhǔn)株比對(duì)，分析序列變異情況，用Mega 4.0軟件作進(jìn)化樹分析，確定HBV基因型。

表1 HBV S區(qū)擴(kuò)增引物

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)組間率的比較，P<0.05為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獻(xiàn)血者HBV感染情況64 400份HBsAg快篩合格獻(xiàn)血者標(biāo)本中，ELISA法共檢出HBsAg陽性862份，陽性率為1.34%。63538份HBsAg篩查陰性樣本中共檢測(cè)出NAT陽性139份，其中HBV DNA陽性84份，獻(xiàn)血者HBV感染率為1.47%，HBV輸血感染隱匿風(fēng)險(xiǎn)率為0.13%；HBsAg篩查陰性樣本中HBV DNA以低病毒載量為主，定量結(jié)果多＜20IU/ml的(70.2%)(見表2)。

表2 84份HBV DNA陽性標(biāo)本病毒載量

2.2 NAT陽性標(biāo)本中HBV感染模式通過對(duì)84份HBV DNA陽性標(biāo)本血清乙肝標(biāo)志物檢測(cè)分析，共發(fā)現(xiàn)可疑窗口期感染6人份(占7.1%)，隱匿性感染63人份(占75.0%)、其他15人份(17.9%)，見表3。

2.3 獻(xiàn)血者中HBsAg陽性人群HBV DNA定量檢測(cè)隨機(jī)選取ELISA法檢測(cè)HBsAg陽性標(biāo)本200人份，共檢出HBV DNA陽性118人份，陽性率為59.0%，其中定量結(jié)果顯示≤102IU/ml者占69.5%(82/118)。

HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb＜20≥20～＜102≥102人份(%)感染狀況HBV DNA定量/(IU/ml) -------+ + + ---+ + + --+ + ------+ -----+ --+ -+ -+ -+ + -+ + + + -+ 4 9 2 0 0 1 0 6 1 8 0 1 1 3 9 2 0 2 0 4 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 6(7.1) 12(14.3) 29(34.5) 2(2.4) 10(11.9) 9(10.7) 1(1.2) 12(14.3) 1(1.2) 2(2.4)可疑窗口期隱匿性感染隱匿性感染隱匿性感染隱匿性感染隱匿性感染隱匿性感染其他(HBsAg+)其他(HBsAg+)其他(HBsAg+)

2.4 HBV基因分型148份HBV DNA陽性獻(xiàn)血者中有66例成功測(cè)序分型，檢出B基因型為47人份(71.2%，47/66)，C基因型為19人份(28.8%，19/ 66)，未檢出其它基因型。

3 討論

我國是HBV感染高流行國家，一般人群HB-sAg攜帶率為7.18%，其中江西地區(qū)13.12%[6]，因此，HBV感染仍是威脅我國輸血安全的重要因素之一。目前，我國采供血機(jī)構(gòu)主要采用ELISA法進(jìn)行HBsAg篩查，其試劑靈敏度可達(dá)0.1～0.2ng/ml[7]，故絕大部分HBV感染獻(xiàn)血者被排除在外。由于ELISA法存在一定的方法局限性，且HBV感染者免疫狀態(tài)存在多樣性，如OBI、病毒變異、感染窗口期等[8]，可致獻(xiàn)血者體內(nèi)存在一定程度的低病毒載量HBV DNA復(fù)制而出現(xiàn)漏檢。若輸注了該類血液制品，能否感染HBV取決于病毒載量、機(jī)體免疫狀態(tài)、計(jì)劃免疫等多方面因素，有輸注含HBV DNA的HBsAg陰性獻(xiàn)血者血液致輸血后HBV感染的個(gè)例報(bào)道，因此有必要在常規(guī)血液篩查的基礎(chǔ)上增加HBV DNA檢測(cè)[9，10]。

目前全國血站核酸檢測(cè)工作已逐步在各地區(qū)普及，主要采用NAT篩查血液中是否存在HBV DNA/HCV RNA/HIV RNA，在降低輸血后HBV感染風(fēng)險(xiǎn)方面具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。報(bào)道數(shù)據(jù)表明我國獻(xiàn)血者經(jīng)HBsAg篩查后的HBV DNA檢出率為1/10000～2/1000，高于美國、德國、日本等發(fā)達(dá)國家[4,5,11-14]，且地區(qū)間差異較大。本研究ELISA法HBsAg檢測(cè)陰性標(biāo)本HBV DNA陽性率為0.13%，略高于國內(nèi)的報(bào)道數(shù)據(jù)，與地屬HBV感染高流行地區(qū)有關(guān)；其血清乙型肝炎標(biāo)志物檢測(cè)提示多為隱匿性感染，病毒載量多以＜20IU/ml為主。因此，綜合HBsAg ELISA法和NAT兩種血液篩查模式，可最大限度的降低輸血后感染風(fēng)險(xiǎn)，從而進(jìn)一步提高輸血安全性。

根據(jù)HBV DNA全基因序列異源性≥8%或S基因序列異源性≥4%的原則，HBV基因型可分為A-J 10種基因型[15，16]，報(bào)道顯示我國A、B、C、D基因型均有分布，其中以B、C基因型為主，北方地區(qū)以C基因型為主，南方地區(qū)以B基因型為主，且隨地區(qū)維度增加，C基因型分布增加，B基因型分布降低，地區(qū)間由于人群類別的關(guān)系，基因型分布差異較大，其中江西地區(qū)的報(bào)道數(shù)據(jù)為B基因型約70%～90%，C基因型為10%～20%不等，D基因型少見，約占1%[17-19]。本研究選取的148 HBV DNA陽性標(biāo)本中，66份測(cè)序分型成功，成功率略低主要與絕大部份HBV感染的獻(xiàn)血參與者被排除，檢測(cè)者病毒載量低，提取難度大有關(guān)；測(cè)序結(jié)果顯示以B基因型為主(71.2%，47/66)，C基因型次之，數(shù)據(jù)略低于以往報(bào)道數(shù)據(jù)，這與南昌地區(qū)獻(xiàn)血者人群特點(diǎn)有關(guān)，但也不排除研究樣本選取偏差因素。

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R193.9,R512.6+2

A

1674-1129(2014)04-0386-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.04.007

錢榕，女，出生于1962年7月，碩士學(xué)位，副主任技師、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)、采供血管理研究。

2014-05-14；

2014-06-04)

江西省科技廳課題項(xiàng)目(編號(hào):20122BBG70115)