張凱華，王飛，胡慧敏，黃華，安沂華，3

(1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京市神經(jīng)外科研究所，北京 100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)，北京三博腦科醫(yī)院，北京 100093;3.武警總醫(yī)院細(xì)胞移植科，北京 100039)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)是一種能夠自我復(fù)制和多向分化的非造血多能干細(xì)胞［1，2］。近十余年來(lái)，已有大量實(shí)驗(yàn)證明了BMMSCs 的多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)特性、定向遷移能力和其與組織工程學(xué)材料聯(lián)合移植用于修復(fù)各系統(tǒng)器官損傷的應(yīng)用前景［3］。小膠質(zhì)細(xì)胞是定居于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞。近來(lái)的研究表明，BMMSCs 移植可能通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［4］，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究旨在通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討B(tài)MMSCs 是否能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)所采用的小膠質(zhì)細(xì)胞是首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所贈(zèng)送的BV2 細(xì)胞系;所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是SPF 級(jí)2 周齡雄性SD 大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2009-0017】;無(wú)菌手術(shù)在北京市神經(jīng)外科研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行［SYXK(京)2013-0009］。

1.1.2 主要試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(high glucose)(Gibco 公司)，LPS(Sigma 公司)，小鼠TNF-α ELISA 試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)，奧林巴斯生物顯微鏡IX71(奧林巴斯)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMMSCs 的分離、培養(yǎng)及傳代

脊椎脫臼法處死SD 大鼠，嚴(yán)格無(wú)菌條件下分離雙下肢，DMEM(high glucose)培養(yǎng)液沖出骨髓，過(guò)200 目細(xì)胞篩后，將濾液于1000 r/min 下離心5 min，棄去上清液，以含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM(high glucose)培養(yǎng)液重懸沉淀，1 ×108/mL 密度接種，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后首次半量換液，以后每3 d 全量換液一次。待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%融合后，按1∶2比例傳代。

1.2.2 BV2 細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代

BV2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM(high glucose)培養(yǎng)液(同BMMSCs 所用培養(yǎng)基)，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天半量換液一次。待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合后，按1∶3比例傳代。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及各組處理

實(shí)驗(yàn)分為4 組，組一:BV2 細(xì)胞以1 ×106/ mL的密度接種于加入DMEM(high glucose)培養(yǎng)液的六孔板中;組二:BV2 細(xì)胞以1 ×106/ mL 的密度接種于加入DMEM(high glucose)培養(yǎng)液的六孔板中，培養(yǎng)液中已預(yù)先加入LPS，LPS 終濃度為100 ng/mL;組三:將Transwell 小室放入六孔板中，上室接種BMMSCs，下室接種BV2 細(xì)胞，細(xì)胞密度均為1 ×106/ mL，兩種細(xì)胞共培養(yǎng)于預(yù)先加入終濃度為100 ng/mL 的LPS 的DMEM(high glucose)培養(yǎng)液中;組四:BMMSCs 以1 × 106/ mL 的密度接種于加入DMEM(high glucose)培養(yǎng)液的六孔板中，培養(yǎng)液中已預(yù)先加入LPS，LPS 終濃度為100 ng/mL。實(shí)驗(yàn)各組所加培養(yǎng)基均為2mL，于同一恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h。

1.2.4 觀察BV2 細(xì)胞形態(tài)變化

光學(xué)顯微鏡下觀察比較組一、組二、組三中BV2細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括貼壁情況、細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài)等。

1.2.5 觀察BV2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

制備電鏡標(biāo)本，透射電鏡下觀察比較組一、組二、組三中BV2 細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，主要包括核仁、線粒體、核糖體等細(xì)胞器的狀態(tài)。

1.2.6 TNF-α 的測(cè)定

根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)，采用ELISA 方法測(cè)定四組中BV2 細(xì)胞炎癥因子TNF-α 的分泌量。

2 結(jié)果

2.1 各組中BV2 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

光鏡下觀察各組細(xì)胞密度依次為:組一＞組三＞組二;組一中BV2 細(xì)胞密集，大部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，絕大多數(shù)細(xì)胞呈典型的梭形形態(tài)，少見(jiàn)單個(gè)呈懸浮狀態(tài)細(xì)胞，見(jiàn)圖1A;組二中BV2 細(xì)胞稀疏，可見(jiàn)大量呈團(tuán)塊狀懸浮狀態(tài)的細(xì)胞團(tuán)，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯少于組一，同時(shí)可見(jiàn)多數(shù)細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，呈阿米巴樣，細(xì)胞突起增多增長(zhǎng)，見(jiàn)圖1B;組三中BV2 細(xì)胞密度小于組一，大于組二，可見(jiàn)少量呈小團(tuán)塊狀懸浮狀態(tài)的細(xì)胞團(tuán)，較組二明顯減少，細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，阿米巴樣細(xì)胞較組二明顯減少，見(jiàn)圖1C。組四中BMMSCs 生長(zhǎng)密集，貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，呈梭形、紡錘形和多角形，見(jiàn)圖2。

圖1 BV2 細(xì)胞光鏡下形態(tài)特征Fig.1 Microscopic appearance of BV2 cells

圖2 BMMSCs 光鏡下形態(tài)Fig.2 Microscopic appearance of BMMSCs

2.2 各組BV2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變

電鏡下觀察各組細(xì)胞可見(jiàn)，組一中可見(jiàn)部分分裂活躍的多核細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞胞核正常大小，核漿比例大致正常，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稍腫脹，少見(jiàn)空泡樣變，游離核糖體密集，可見(jiàn)大量有翻譯功能的多聚核糖體，見(jiàn)圖3A;組二中BV2 細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)到多核細(xì)胞，可見(jiàn)胞核處于固縮、碎裂、溶解狀態(tài)的凋亡細(xì)胞，部分存活細(xì)胞中可見(jiàn)核漿比例倒置，線粒體出現(xiàn)明顯腫脹或者固縮，空泡樣變較其他兩組明顯多見(jiàn)，游離核糖體相對(duì)稀疏，但是少見(jiàn)多聚核糖體，見(jiàn)圖3B;組三中BV2 細(xì)胞內(nèi)少見(jiàn)多核細(xì)胞，未見(jiàn)到處于固縮、碎裂、溶解狀態(tài)的凋亡細(xì)胞，偶見(jiàn)核漿比例倒置細(xì)胞，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常，腫脹、固縮線粒體少見(jiàn)，空泡樣變明顯少于組二，游離核糖體密集，多聚核糖體多于組二、少于組一，見(jiàn)圖3C。因光鏡下明確組四中為典型的BMMSCs，與BV2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較無(wú)意義，所以未做該組電鏡切片。

2.3 ELISA 方法檢測(cè)TNF-α

采用ELISA 方法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)四組細(xì)胞上清液中的TNF-α，結(jié)果顯示組三TNF-α 濃度明顯低于組二;未被LPS 誘導(dǎo)激活的組一與不含小膠質(zhì)細(xì)胞的組四濃度明顯低于組二、組三，兩組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

3 討論

BV2 細(xì)胞是一種基本具備原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、表型以及各項(xiàng)功能特點(diǎn)，相對(duì)較易培養(yǎng)的成熟細(xì)胞系［5］，廣泛應(yīng)用于研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)方面的體外研究。LPS 可以誘導(dǎo)BV2細(xì)胞激活，建立BV2 細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和毒性的經(jīng)典細(xì)胞模型［6］。BMMSCs 的免疫調(diào)節(jié)特性及其臨床應(yīng)用也已被大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床前期研究證實(shí)［7］。本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討B(tài)MMSCs 在LPS 激活的BV2 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用。

圖3 BV2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征Fig.3 Ultrastructural features of the BV2 cells

圖4 四組細(xì)胞上清液中的TNF-α 分泌量比較Fig.4 The quantity of TNF-α in the supernatant fluid of four groups

研究發(fā)現(xiàn)，BMMSCs 可以明顯影響LPS 誘導(dǎo)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及炎癥因子的分泌。相同培養(yǎng)條件下，被同濃度的LPS 誘導(dǎo)活化后，光鏡下可見(jiàn)共培養(yǎng)組的BV2 細(xì)胞無(wú)論從細(xì)胞密度、貼壁情況，還是呈團(tuán)塊狀懸浮狀態(tài)的失活細(xì)胞的數(shù)量，均明顯好于非共培養(yǎng)的BV2 細(xì)胞組，說(shuō)明相同程度的LPS 誘導(dǎo)激活條件下，BMMSCs 可以減輕炎癥反應(yīng)對(duì)BV2 細(xì)胞的損傷程度。透射電鏡下比較前三組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，共培養(yǎng)組內(nèi)處于核固縮、核碎裂、核溶解狀態(tài)的細(xì)胞明顯少于LPS 激活BV2 細(xì)胞組，說(shuō)明相同程度的LPS 誘導(dǎo)激活條件下，BMMSCs 可以抑制炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的BV2 細(xì)胞凋亡。與共培養(yǎng)組和單純BV2 細(xì)胞組相比，LPS 激活BV2 細(xì)胞組中呈腫脹或固縮狀態(tài)的線粒體明顯增多，核糖體密度明顯減低，有翻譯功能的多聚核糖體數(shù)目明顯減少，說(shuō)明相同程度的LPS 誘導(dǎo)激活條件下，BMMSCs 可以減輕炎癥反應(yīng)對(duì)BV2 細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的影響，因?yàn)榧?xì)胞維持自身存活及進(jìn)行分裂增殖等功能的過(guò)程中需要正常結(jié)構(gòu)的線粒體提供能量，同時(shí)需要正常結(jié)構(gòu)的核糖體作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器，保證細(xì)胞各種功能的實(shí)現(xiàn)等等。以上均說(shuō)明BMMSCs 能夠減輕炎癥反應(yīng)過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞受到的炎性損傷。

TNF-α 是一種具有代表性的炎癥介質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。它由小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生并對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組較LPS 激活BV2 細(xì)胞組TNF-α 有明顯降低，說(shuō)明BMMSCs 可以通過(guò)非細(xì)胞間接觸的方式減少BV2 細(xì)胞分泌的炎癥因子，減輕炎癥反應(yīng)的程度，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到抑制作用。國(guó)外雖然已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明BMMSCs移植可以減少組織周?chē)装Y因子TNF-1α、IL1β 等的表達(dá)量，但是并沒(méi)有證明炎癥因子的減少是BMMSCs 直接作用于小膠質(zhì)細(xì)胞引起的，還是通過(guò)作用于其他細(xì)胞，比如中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多的星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)發(fā)揮作用，也沒(méi)有證明這種作用是通過(guò)細(xì)胞間接觸的方式還是旁分泌等其他的方式發(fā)揮作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:BMMSCs 能夠通過(guò)非細(xì)胞間接觸的方式抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減少小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥因子的表達(dá)，維持小膠質(zhì)細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。雖然大量的研究已經(jīng)報(bào)道過(guò)BMMSCs 的免疫抑制作用，但其潛在機(jī)制仍然不是很清楚，我們的研究說(shuō)明BMMSCs 能夠通過(guò)某種或某幾種可通過(guò)擴(kuò)散方式穿越Tranwell 膜的可溶性因子發(fā)揮其對(duì)免疫炎癥反應(yīng)的抑制作用，細(xì)胞間接觸并不是間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用的前提條件。本研究雖然初步證實(shí)了BMMSCs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制作用，但是BMMSCs 的數(shù)量與其發(fā)揮抑制效應(yīng)的關(guān)系及隨著時(shí)間推移BMMSCs 抑制效應(yīng)強(qiáng)弱的變化都有待于進(jìn)一步研究，這些研究將為我們揭開(kāi)BMMSCs 發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的作用機(jī)制的神秘面紗提供線索、指明方向。

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