徐艷陽，陳佳麗，李科靜，林雨婷，朱志紅，吳海成

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022）

玉米苞葉為禾本科玉米屬一年生草本植物玉米（Zea mays L.）的外苞葉。資料記載玉米的根、葉、花柱、軸均可供藥，有調(diào)中開胃、益肺寧心、利水通淋、抗氧化和解毒去疾之功效[1-2]。我國(guó)是玉米生產(chǎn)和種植大國(guó)，玉米產(chǎn)量居世界第二位[3]，種植面積約2 449.83 萬hm2，每公頃玉米可采集苞葉600 kg，所以玉米苞葉資源十分豐富，易于收集。但是大量的玉米苞葉沒有得到有效利用。黃酮類化合物在植物中分布最廣，是天然產(chǎn)物化學(xué)領(lǐng)域中研究較成熟的一類物質(zhì)，有預(yù)防心血管疾病、防癌抗癌、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗菌抗病毒、抗炎抗過敏、止血鎮(zhèn)痛等功效[4-5]，被列為保健食品的一類功能因子。

目前關(guān)于玉米苞葉中黃酮類成分的提取和功能研究較少。國(guó)內(nèi)學(xué)者王艷[6]對(duì)玉米苞葉中黃酮類化合物進(jìn)行了提取和鑒定。孟雪[7]等用大孔樹脂分離純化了玉米苞葉總黃酮。魯萍[7]等對(duì)玉米苞葉總黃酮的超聲提取和體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。張沐新[8]等對(duì)玉米苞葉中新黃酮類化合物進(jìn)行了分離和鑒定研究。甄艷軍[9]等研究發(fā)現(xiàn)玉米苞葉水提物具有降低動(dòng)脈硬化家兔血脂及防治動(dòng)脈硬化的作用。微波輔助提取是近年來發(fā)展較快的一種天然產(chǎn)物提取技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、易控制、快速和提取率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于天然植物中黃酮類化合物、生物堿、皂苷類等有效成分的提取[10-15]。因此本文利用微波法對(duì)玉米苞葉中黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行研究，為玉米苞葉的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米苞葉采集于長(zhǎng)春市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，清洗，烘干，粉碎過60 目篩，備用。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥97 %）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉：北京化工廠生產(chǎn)；所用試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

FW177 型中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；AL104 型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；LD4-2A 型雷勃爾低速離心機(jī)：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；MM721AAU-PM 美的微波爐：佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司；TU-1810 型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 玉米苞葉中黃酮的提取工藝

玉米苞葉→清洗→烘干→粉碎→微波處理→離心→定容→測(cè)定

1.4.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取20.00 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL 容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，得到2.00 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液[13]。再用移液管準(zhǔn)確量取2.00 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用60%乙醇定容、搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液。

1.4.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加入60%乙醇溶液至4.00 mL，5 %NaNO2溶液0.50 mL，10 %的Al（NO3）3溶液0.50 mL，搖勻后靜置10 min，再加入4.00 mL 5%NaOH 溶液，用60%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻后靜置10 min，然后在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)（y）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 玉米苞葉中黃酮含量的計(jì)算

采用硝酸鋁顯色法[16]測(cè)定玉米苞葉中黃酮的含量，其計(jì)算公式如下：

式中：S 為玉米苞葉中黃酮含量，（mg/g）；C 為玉米苞葉提取液中黃酮的濃度，（mg/mL）；V 為玉米苞葉提取液的體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為玉米苞葉的質(zhì)量，g。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 微波時(shí)間對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取玉米苞葉樣品1.00 g，用60%乙醇溶液按料液比1 ∶10 溶解，在功率為119 W 微波爐中提取2、3、4、5、6 min，然后離心，定容到10 mL，測(cè)量玉米苞葉中黃酮的含量。

1.5.2 乙醇濃度對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取玉米苞葉樣品每份1.00 g，分別按料液比1 ∶10，加入濃度為60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液，在功率為119 W 微波爐中提取2 min，然后離心，定容，測(cè)量玉米苞葉中黃酮的含量。

1.5.3 料液比對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取玉米苞葉樣品1.00 g，分別按料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50，加入60%乙醇溶液，在功率為119 W 微波爐中提取2 min，然后離心，定容，測(cè)量上玉米苞葉中黃酮的含量。

1.5.4 微波功率對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取玉米苞葉樣品1.00 g，按料液比1 ∶10、加入60%乙醇溶液，分別在功率為119、252、385、539、700 W 微波爐中提取2 min，然后離心，定容，測(cè)量玉米苞葉中黃酮的含量。

1.6 玉米苞葉中黃酮提取條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Benhnken（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化研究，各因素的水平設(shè)置及編碼見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Coded variables and levels of facters

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design-Expert 8.05 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，根據(jù)回歸方程、響應(yīng)曲面圖及等高線圖分析出各因素之間交互作用的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.4.3 在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，其結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1 可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y=12.171x-0.001 3，R2=0.999 8，該方程的回歸系數(shù)較高，說明蘆丁的濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 微波時(shí)間對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響

按1.5.1 中的操作方法考查微波時(shí)間對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響，其結(jié)果見圖2。

圖2 微波時(shí)間對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.2 Effects of microwave time on flavonoids yield from corn bracts

由圖2 可知，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米苞葉中黃酮含量先升高后降低，當(dāng)微波時(shí)間為3 min 時(shí)，玉米苞葉中黃酮含量最高。其原因可能為當(dāng)微波時(shí)間大于3 min 時(shí)，提取液體積損失較多，同時(shí)有部分玉米苞葉中黃酮類物質(zhì)被氧化，因此微波時(shí)間選擇3 min 為宜。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響

按1.5.2 中的操作方法考查乙醇濃度對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響，其結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on flavonoids yield from corn bracts

由圖3 可知，隨著乙醇濃度的增加，玉米苞葉中黃酮含量逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，黃酮含量最高，當(dāng)乙醇濃度大于80%后，黃酮的含量降低，其原因可能為當(dāng)乙醇濃度大于80%后，玉米苞葉中脂溶性物質(zhì)溶出增多，干擾了黃酮類物質(zhì)的提取和檢測(cè)。但是由于脂溶性物質(zhì)溶出增多給玉米苞葉中黃酮的純化帶來了較大的麻煩，從成本和黃酮含量的角度綜合考慮，乙醇的濃度選擇80%較佳。

2.2.3 料液比對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響

按1.5.3 中的操作方法考查料液比對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響，其結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.4 Effects of Solid-Liquid ratio on flavonoids yield from corn bracts

由圖4 可知，當(dāng)料液比為1 ∶20 時(shí)，玉米苞葉中黃酮含量最高，其原因可能為當(dāng)料液比大于1 ∶20時(shí)，玉米苞葉中雜質(zhì)溶出較多。從增加提取率和減少溶劑用量節(jié)約成本等方面綜合考慮，料液比選擇1 ∶20較合適。

2.2.4 微波功率對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響

按1.5.4 中的操作方法考查微波功率對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響，其結(jié)果見圖5。

圖5 微波功率對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.5 Effects of microwave power on flavonoids yield from corn bracts

由圖5 可知，隨著微波功率的增大，玉米苞葉中黃酮含量呈下降趨勢(shì)，其原因可能為當(dāng)微波功率過大即超過539 W 后提取液容易產(chǎn)生爆沸，損失較大。因此微波功率選擇252 W 為宜。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化及分析

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

以微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比和微波功率為影響因素，應(yīng)用BBD 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化玉米苞葉中黃酮的提取條件，方差分析結(jié)果見表2～表3。

由表2 可知，設(shè)立了5 個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)即零點(diǎn)來估計(jì)試驗(yàn)誤差。利用Design-Expert 8.0.5 軟件建立響應(yīng)面二次回歸模型，以玉米苞葉中黃酮含量為響應(yīng)值Y（%），經(jīng)二次回歸擬合后得到回歸方程為：

該方程的回歸系數(shù)為R2=0.902 1，因此可以用該回歸方程來表示各因素值和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系。最佳理論預(yù)測(cè)條件為：微波時(shí)間4 min、乙醇濃度84.89%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率355.73 W，在此條件下玉米苞葉中黃酮含量可達(dá)到0.613（mg/g）。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of Response surface design

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA of regression model

表3 中微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比和微波功率的一次項(xiàng)均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）；在二次項(xiàng)中，乙醇濃度和微波功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著；在交互相中，微波時(shí)間和乙醇濃度的交互作用及微波時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)玉米苞葉中黃酮含量有顯著性影響，而其它因素的交互作用影響不顯著。由表3 可看出，模型的顯著水平為極顯著，方程的失擬項(xiàng)不顯著，說明該回歸模型是可靠的，因此可以用該回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.3.2 響應(yīng)曲面圖形分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于試驗(yàn)因素A、B、C 和D 所構(gòu)成的三維空間曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，響應(yīng)面圖形可以直觀地反映各因素及他們之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[17-18]。對(duì)交互作用顯著的響應(yīng)面圖形進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6 和7。

由圖6 可以看出，玉米苞葉中黃酮含量隨微波時(shí)間的增大而升高；隨乙醇濃度的增加先增大后減小。微波時(shí)間對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響顯著。與微波時(shí)間相比，乙醇濃度對(duì)黃酮含量的影響不太顯著，且隨其數(shù)值的增加或減少響應(yīng)值的變化較小。由圖7 看出，玉米苞葉中黃酮含量隨微波時(shí)間的增大而升高；隨料液比的增加而降低。微波時(shí)間對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響顯著。與微波時(shí)間相比料液比對(duì)黃酮含量的影響不太顯著，且隨料液比的增加或減少響應(yīng)值的變化較小。

圖6 微波時(shí)間和乙醇濃度交互作用對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.6 Effects of microwave time and ethanol concentration interaction on flavonoids yield from corn bracts

圖7 微波時(shí)間和料液比交互作用對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響Fig.7 Effects of microwave time and Solid-Liquid rate interaction on flavonoids yield from corn bracts

2.3.4 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

由二次回歸方程得玉米苞葉中黃酮提取工藝的最佳理論預(yù)測(cè)條件為：微波時(shí)間4 min、乙醇濃度84.89%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率355.73 W，在此條件下玉米苞葉中黃酮提取率為0.613 mg/g。為了檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際情況是否一致，考慮到實(shí)際情況，最佳工藝條件修正為：微波時(shí)間4 min、乙醇濃度85%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率385 W，在此條件下進(jìn)行五次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到玉米苞葉中黃酮含量為（0.586±0.024）mg/g，與預(yù)測(cè)值基本相符，說明該二次回歸方程與實(shí)踐情況擬合較好。

3 結(jié)論

1）研究微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比和微波功率對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)得到影響玉米苞葉中黃酮含量的因素順序?yàn)椋何⒉üβ剩疚⒉〞r(shí)間＞料液比＞乙醇濃度，且對(duì)玉米苞葉中黃酮含量的影響均顯著。

2）以玉米苞葉中黃酮含量為Y（%），經(jīng)二次回歸擬合得到的回歸方程為：

Y（%）=0.52+0.03A+0.02B-0.02C+0.03D+0.03AB-0.02AC+0.01BC+0.01BD+0.01A2-0.04B2-0.02C2-0.02D2（R2=0.9021）

3）利用Design-Expert 8.0.5 軟件建立響應(yīng)面二次回歸模型，得出微波提取玉米苞葉中黃酮的最佳工藝條件為：微波時(shí)間4 min、乙醇濃度85%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率385 W，在此條件下玉米苞葉中黃酮含量為（0.586±0.024）mg/g，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，可為玉米苞葉中黃酮類化合物的工業(yè)提取工藝研究提供參考。

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