何曉哲，李梅青，陳健，徐敏

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036）

我國(guó)是大豆生產(chǎn)大國(guó)，每年廢棄的大豆渣雖然很多高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的成分，但利用率很低[1]，特別是其中含量最高的膳食纖維。膳食纖維包括不可溶膳食纖維（IDF）和可溶性膳食纖維（SDF）。SDF 具有防止膽結(jié)石、排除體內(nèi)有害金屬離子、防止糖尿病、降低血清及膽固醇、防止高血壓和心臟病等作用[2]；而IDF 則對(duì)肥胖癥、便秘、腸癌等有效[3]，膳食纖維成為調(diào)節(jié)機(jī)體功能的“第七類營(yíng)養(yǎng)素”，是一種很有開(kāi)發(fā)前景的新型功能性資源，已經(jīng)成為熱門話題[4-6]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外食品工作者嘗試了不同的提取和改良方法進(jìn)行大豆膳食纖維的提取，主要集中在化學(xué)分離法[7]、化學(xué)試劑-酶結(jié)合分離法[8]、超聲波輔助提取[9-10]、膜分離法[11]、發(fā)酵法[12-14]等。其中，發(fā)酵法被認(rèn)為是一種相對(duì)安全、高效、低成本的高品質(zhì)膳食纖維制備和改良方法，但前期研究的比較少，其發(fā)酵菌種大多僅采用綠色木霉、粗壯脈紋孢菌等少數(shù)常見(jiàn)單一菌種，得率也僅在12%～15%。

本文以豆渣為原料，以黑曲霉和綠色木霉[15]混合菌種進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，充分利用兩種菌種菌體生長(zhǎng)快，周期短的優(yōu)點(diǎn)，利用其產(chǎn)生的纖維素酶降解豆渣中的不可溶性膳食纖維，充分提高大豆膳食纖維的活性，為提高豆渣的高效利用及功能性改善提供一種更高效、可行的方法。

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

豆渣：安徽人人福食品公司提供；綠色木霉、黑曲霉：由合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院微生物資源綜合利用研究室提供；MES：美國(guó)AMIESCO 公司；TRIS：上海源葉生物有限公司；乙醚，無(wú)水乙醇，濃硫酸，氫氧化鈉，丙酮等均為分析純。

1.1.2 主要儀器

VD-650 型桌上式凈化工作臺(tái)：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；LD2X-50KB 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；ZHWY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智成分析儀器制造有限公司；EYELAFDU-2100 真空冷凍干燥儀：上海愛(ài)郎儀器有限公司；FA1104A 萬(wàn)分之一電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；DHP-916 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海恒科技有限公司；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9143BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

種子培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，葡萄糖30 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：脫脂大豆渣粉40 g，K2HPO42 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CMC-Na 10 g，MnSO4·H2O 0.001 5 g，ZnSO4·7H2O 0.001 5 g，氯化鈣0.3 g，氯化鈷0.002 g，蛋白胨0.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 為中性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵活化工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

預(yù)備豆渣：洗凈、烘干、粉碎，采用乙醚浸提24 h，置50 ℃的烘箱中烘干，過(guò)40 目篩，放置干燥器備用。

配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基：按照1.1.3 進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制，取100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基至于250 mL 三角錐形瓶中，封口。

接種：挑取菌種孢子接入種子培養(yǎng)基，28 ℃，24 h～48 h 于恒溫培養(yǎng)箱中，活化后的菌種接入種子發(fā)酵液中，28 ℃，2 d～5 d 置于搖床培養(yǎng)箱，最后取一定培養(yǎng)液于發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別對(duì)發(fā)酵過(guò)程中黑曲霉與綠色木霉比例、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、菌種加液量以及發(fā)酵初始pH 對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性，確定響應(yīng)面優(yōu)化因素。

1.3.2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Excel 和Design Expert.8.0.6 軟件，選取影響較大的因素，以可溶性膳食纖維得率為響應(yīng)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

在其他固定發(fā)酵條件下，考察單因素的影響效力，其結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同發(fā)酵因素對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響Fig.1 Influence of different fermentation factors on the SDF activity

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：前三種因素普遍對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響均呈現(xiàn)先上升后下降的特點(diǎn)，菌種比例在2 ∶1 時(shí)可溶性膳食纖維得率最高，這可能是因?yàn)榛旌暇N的協(xié)和作用的調(diào)節(jié)，不同比例，協(xié)調(diào)的效果不同，只有達(dá)到最佳協(xié)調(diào)效果時(shí)所達(dá)到的降解作用才能最大；發(fā)酵時(shí)間在48 h 時(shí)為最高點(diǎn)，原因可能為在48小時(shí)前，菌種中的纖維素、半纖維酶對(duì)豆渣中的不可溶性膳食纖維進(jìn)行講解，使不可溶性膳食纖維的糖苷鍵斷裂，生成小分子多糖，轉(zhuǎn)化為可溶性膳食纖維，之后到達(dá)一定程度，微生物生長(zhǎng)需要作用了一部分小分子糖，呈現(xiàn)了下降的趨勢(shì)；而發(fā)酵溫度達(dá)到26 ℃時(shí)效果最佳，這是因?yàn)榘l(fā)酵的溫度對(duì)于微生物的生長(zhǎng)的也是重要的因素之一，溫度過(guò)低，微生物生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶的速度就緩慢，而溫度過(guò)高，微生物容易過(guò)早的老化，產(chǎn)酶的效果也迅速的降低。

因此，綜合上述內(nèi)容，在菌種比例（黑曲霉：綠色木霉）為2 ∶1（圖1 中菌種比例橫坐標(biāo)1、2、3、4、5 分別對(duì)應(yīng)1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、2 ∶1、3 ∶1），發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為26 ℃的時(shí)候，各單因素的作用效力最大。其次，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵pH 與發(fā)酵菌種加液量變化對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響不明顯，根據(jù)實(shí)驗(yàn)顯著性的原則，不將其納入響應(yīng)面優(yōu)化因素。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合單因素結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵菌種比例、發(fā)酵時(shí)間以及發(fā)酵溫度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中因素與水平設(shè)計(jì)件表1，以此確定最優(yōu)可溶性膳食纖維得率。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平編碼表Table 1 Experimental design of 4 factors and 3 levels in response surface method

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Results of data analysis by Box-Behnken design

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

通過(guò)Design-Expert.8.0.6 軟件對(duì)表2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，建立二元多次回歸方程，Y=22.53+0.71A-1.09B+0.70C+1.13AB-1.65AC-1.31BC-3.40A2-3.03B2-2.34C2，對(duì)該方程的回歸分析和方差分析如表3 所示。

由表3 可知，實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值的決定系數(shù)R2值為98.04%，即模型響應(yīng)值的變化有98.04%來(lái)自于所選變量，能較好地描述試驗(yàn)結(jié)果，并且修訂系數(shù)R2adj為95.51%，P＜0.01。故該回歸模型可判定為顯著，擬合情況良好，采用響應(yīng)面法針對(duì)發(fā)酵豆渣中可溶性膳食纖維得率的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法具有可行性，并且所得回歸方程模型有效、可靠。

從表3 對(duì)回歸方程系數(shù)顯著性的檢驗(yàn)可知，單因素的影響順序?yàn)锽＞A＞C，即發(fā)酵時(shí)間＞菌種比例＞發(fā)酵溫度。各因素中A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2達(dá)到了顯著水平（P 值小于0.05）。其中，發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵比例、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度、發(fā)酵比例與發(fā)酵溫度交互作用顯著，繪制各因素交互響應(yīng)面曲面圖，見(jiàn)圖2～圖4。

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Regression analysis results of extraction parameter of total flavones

圖2 菌種比例（A）和發(fā)酵時(shí)間（B）對(duì)SDF 得率的等高線和響應(yīng)面圖Fig.2 Contour plots s and Response surface plot for the effect of strain ration（A）and fermentation time（B）on SDF yield

圖3 菌種比例（A）和發(fā)酵溫度（C）對(duì)SDF 得率的等高線和響應(yīng)面圖Fig.3 Contour plots s and Response surface plot for the effect of strain ration（A）and fermentation temperature（C）on SDF yield

由圖2，圖3，圖4 可知，等高線扁平，并且所示曲面圖陡峭，表明因素之間相互影響大。使用軟件Design-Expert.8.0.6 對(duì)2.2.1 所述二次回歸方程進(jìn)行優(yōu)化計(jì)算，得到發(fā)酵黃豆渣中可溶性膳食纖維最佳實(shí)驗(yàn)方案是：菌種比例2.02，發(fā)酵時(shí)間45.35h，發(fā)酵溫度26.41 ℃，SDF 的得率達(dá)到22.73%。考慮到可操作性，將最優(yōu)條件定位菌種比例2 ∶1，發(fā)酵時(shí)間45.5 h，發(fā)酵溫度26.4℃。用此最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到可溶性膳食纖維的得率為22.94%，與理論值較為接近，相對(duì)誤差為0.94%，小于1%，由此表明實(shí)際提取率與回歸方程所預(yù)測(cè)理論值相吻合。

2.3 冷凍干燥產(chǎn)品特性

對(duì)最佳工藝條件（菌種比例2∶1，發(fā)酵時(shí)間45.5 h，發(fā)酵溫度26.4 ℃）下的產(chǎn)品進(jìn)行成分組成分析、感官評(píng)定，得到：DF 得率為52.67%，SDF 得率為22.76%，SDF 約占DF 的43.21%；產(chǎn)品淡黃色，粉末顆粒度小，質(zhì)地均勻，口感細(xì)膩，氣味淡香。

3 結(jié)論

圖4 發(fā)酵時(shí)間（B）和發(fā)酵溫度（C）對(duì)SDF 得率的等高線和響應(yīng)面圖Fig.4 Contour plots s and Response surface plot for the effect of fermentation temperature（B）an d fermentation time（C）on SDF yield

以豆渣為原料采用黑曲霉與綠色木霉進(jìn)行混合發(fā)酵制備高活性膳食纖維的方案是可行的。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)，并使用Design-Expert.8.0.6 軟件建立響應(yīng)面法模型，方差分析表明其回歸方程擬合性較好，得到發(fā)酵豆渣中可溶性膳食纖維最佳提取工藝條件為：菌種比例2 ∶1，發(fā)酵時(shí)間45.5 h，發(fā)酵溫度26.4 ℃。在此條件下，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的實(shí)際平均提取率為22.94%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.94%，且產(chǎn)品感官淡黃色，粉末顆粒度小，質(zhì)地均勻，口感細(xì)膩，氣味淡香。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)選取的混合菌種是合適的，能夠得到較高的水溶性膳食纖維得率，為提高豆渣的綜合利用率及功能性提供了一種更高效的方法。

[1] 陳霞,趙貴興,孫子重.大豆加工副產(chǎn)物-豆渣及油腳的利用[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,6:57-60

[2] Tamura Y, Takenaka T. Antioxidative activity of water soluble extracts from okara fermented with Bacillus natto and Rizopus oligosporus[J].Journal of Japanese Society of Food Science and Technology,1999,46(9):561-569

[3] Hill M J.Steroid nuclear dehydrogenation and colon cancer[J]．Am J Clin Nutri,1974,27:4475-4479

[4] 張慧,肖志剛,王東.豆渣水溶性膳食纖維提取工藝的研究現(xiàn)狀與展望[J].大豆科技,2011(5):27-30

[5] 王金亭.膳食纖維及其生理保健作用的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn),2007,7(9):1414-1416

[6] 鄭建仙.功能性食品[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1995

[7] 王慶玲,董娟,汪繼亮.豆渣中可溶性膳食纖維提取工藝的研究[J].中國(guó)釀造,2011(3):135-137

[8] 柳嘉,李堅(jiān)斌,劉健,等.響應(yīng)面法優(yōu)化豆渣水溶性膳食纖維提取過(guò)程的研究[J].食品科技,2011,36(9):276-280

[9] 郭希娟,馬萍,張桂芳.響應(yīng)面法在可溶性膳食纖維超聲提取中的應(yīng)用[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2012,12(13):104-111

[10] Shari B, Svetlana Z, Jochen W. Molecular weight and degree of acetylation of high-intensity ultrasonicated chitosan[J]. Food Hydrocolloids,2005,19(5):821-830

[11] 徐廣超.豆渣可溶性膳食纖維的制備及功能性的研究[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2005

[12] 王夫杰,魯緋,張建,等.微生物發(fā)酵豆渣食品的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2007,28(9):212-215

[13] 薛振環(huán),鄧澤元,范亞葦,等.粗壯脈紋孢菌發(fā)酵對(duì)豆渣中膳食纖維影響的研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(3):156-158

[14] 熊俐,吳士業(yè),張永剛,等.綠色木霉發(fā)酵制備黃豆渣膳食纖維的研究[J].食品與發(fā)酵科技,2010,46(3):75-78

[15] 劉穎,張瑋瑋,王馥.綠色木霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(3):128-130