李忠英，陳杰山，羅躍中，吳永堯

（1.湖南化工職業(yè)技術學院，湖南株洲 412004；2.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128）

隨著全球石油能源的日趨枯竭及環(huán)境污染的加劇，開發(fā)新的綠色能源勢在必行。燃料酒精替代汽油能源將逐漸成為發(fā)展趨勢[1-2]。目前，采用燃料酒精生產(chǎn)多采用微生物發(fā)酵方式。生產(chǎn)酒精的菌種主要以酵母菌為主，酒精酵母的優(yōu)劣不僅直接影響發(fā)酵率的高低，而且會影響酒精的產(chǎn)量和品質(zhì)。在酒精發(fā)酵時，產(chǎn)生的高濃度酒精和相對較高的發(fā)酵溫度對產(chǎn)酒率影響較大，高濃度酒精會限制酵母菌的生長繁殖，對酒精發(fā)酵產(chǎn)生強烈的抑制作用；而耐高溫酵母能減少生產(chǎn)中由于降溫所帶來的麻煩和費用。因此，高產(chǎn)酒精酵母的選育和發(fā)酵工藝的改進是實現(xiàn)酒精濃醪發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵[3]。我國也一直將選育優(yōu)良的酒精酵母菌種和酒精發(fā)酵新工藝研究列為重點研究課題。

本項研究從自然界中篩選分離出具有較強溫度和酒精耐受性的酵母菌TJ-18并對其進行初步鑒定，旨在篩選培育適用于酒精工業(yè)發(fā)酵的新菌種。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌樣來源

各種腐敗水果、葡萄園里土壤、湘天橋菜市場甜酒醪、湘鄉(xiāng)燕京啤酒廠酒醪、學生食堂下污水及實驗室教學用酵母菌等。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

1.1.2.1 富集培養(yǎng)基（L）

含10%酒精麥芽汁（8°Brix）、含14%的酒精麥芽汁（10°Brix）。

1.1.2.2 分離馴化培養(yǎng)基（L）

麥芽汁（8°Brix）及酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）：配方：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。

1.1.2.3 初篩培養(yǎng)基

TTC上層培養(yǎng)基為TTC0.05g，葡萄糖0.5g，水1L；TTC下層培養(yǎng)基為YPD瓊脂。

1.1.2.4 復篩培養(yǎng)基

加杜氏小管的YPD培養(yǎng)基。

1.1.2.5 酵母菌鑒定培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配方及其配制，參考《The Yeast》[4]和《常見與常用真菌》[5]。

1.1.2.6 酵母菌保藏用培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，分離出的菌種保存在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基試管斜面上，每隔兩個月轉(zhuǎn)接一次。

本研究中培養(yǎng)基除特別注明外均采用121℃蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 實驗試劑

1.1.3.1 原麥芽汁

取自湘鄉(xiāng)市燕京（國人）啤酒有限公司（原麥芽汁13°Brix）。

1.1.3.2 酶制劑

a-淀粉酶：酶活力3 000 IU/g，糖化酶：酶活力17 400 IU/g。

1.1.3.3 其他化學試劑

放線酮、乙胺、尸胺、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、次甲基藍、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、乙酸鋅、氫氧化鈉、鹽酸、甲基紅、醋酸鉛、硫酸鈉、乙醚等均為分析純。

1.1.4 實驗儀器

UV-2550紫外分光光度計：日本島津制作所；電子天平：梅特勒電子儀器有限公司；超凈工作臺：江蘇凈化設備廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安；HPS-250生化培養(yǎng)箱：哈爾濱市東明；LDZX-50FAS恒溫水浴箱：上海瑞仰凈化裝備有限公司；QYC-21全溫空氣搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；顯微鏡：江南光電等。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理

從各個基質(zhì)中采用隨機取樣原則收集樣品，裝入200 mL錐形瓶裝100 mL無菌水，加入玻璃珠以及所采集的樣品放置在調(diào)速多用振蕩器（HY4）振蕩1 h，打碎菌膠團，釋放游離菌。

1.2.2 富集培養(yǎng)

在震蕩后的菌懸液中取5 mL樣品分別加入到已滅菌的含10%（體積分數(shù)）酒精的培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)入酒精濃度為14%（體積分數(shù)）的培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)72 h，鏡檢。若有則取1 mL接入YPD固體平皿中，40℃培養(yǎng)2 d～3 d，待長出菌落后，選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進一步劃線分離2次～3次，經(jīng)鏡檢為純種后分別轉(zhuǎn)入YPD固體斜面，冰箱保存。

1.2.3 酵母菌的篩選

1.2.3.1 酵母菌一級篩

TTC法[6]：在一定培養(yǎng)基上培養(yǎng)的酵母菌落上覆蓋一層TTC顯色劑后會顯不同顏色，產(chǎn)酒精能力強的酵母菌落成深紅色，次之為粉紅色。將分離得到的各菌株依次接入TTC下層培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24 h，長出菌落然后倒入TTC上層培養(yǎng)基，40℃下保溫（陰暗處）2 h～3 h。比較各菌株之間的產(chǎn)酒精能力。初篩出性狀優(yōu)良的酵母菌株。試驗重復3次。

1.2.3.2 酵母菌二級篩

酵母菌的二級篩：將酵母菌分別接入帶有杜氏小管的不同的YPD液體試管中，添加不同濃度酒精下40℃培養(yǎng)，分別在12、24 h和48 h觀察杜氏小管中產(chǎn)氣情況。試驗重復3次。

1.2.3.3 酵母菌三級篩

麥芽汁發(fā)酵法：二級篩選出的菌株活化后接入麥芽汁培養(yǎng)基中增菌使活菌濃度達到107個/mL，然后取6 mL裝入300 mL帶濾芯的發(fā)酵瓶中，加入200 mL麥芽汁40℃下培養(yǎng)72 h，每日稱重，記錄每日失重情況，待發(fā)酵結束時計算總失重，并對發(fā)酵液進行分析（可溶性固形物，酒精度，還原糖）。試驗重復3次，復篩得到性狀最為優(yōu)良的菌株。

1.2.4 酵母菌的鑒定

酵母鑒定方法參考《The Yeast：a taxonomic study》（第三版），對其進行形成及培養(yǎng)特征觀察，同時進行發(fā)酵糖類、同化碳源、同化氮源及無維生素生長試驗。

1.2.5 酒精度的測定

取100 mL成熟發(fā)酵醪，加入100 mL蒸餾水，蒸餾出100 mL液體，搖勻后用酒精計和溫度計分別測定其酒度和溫度，然后查表校正為20℃酒精濃度。

2 結果分析

2.1 初篩結果

本實驗將采集的樣品置于含10%乙醇培養(yǎng)基中，使在含酒精培養(yǎng)基的不生長的菌株被淘汰掉，而能適應的菌株被保留下來，富集及馴化培養(yǎng)的主要目的是使目標菌株能夠適應其生長環(huán)境并旺盛生長。從不同地區(qū)不同地點共采集樣品12份，從中共分離得到酵母菌144株，其中來自各種腐敗水果的酵母32株；來自葡萄園里土壤的酵母20株；來自菜市場甜酒糟的酵母34株；來自啤酒廠酒醪的酵母21株；來自學生食堂下污水的酵母12株；來自教學用酵母菌25株。分離酵母結果見表1。

表1 酵母菌的分離初篩結果Table 1 Segregation of yeast screening results

從表1可看出，菜市場甜酒糟和各種腐敗水果中酵母菌數(shù)量較多，分離到的能耐14%（體積分數(shù)）酒精的菌株也多；葡萄園里土壤和污水由于菌項復雜，含有的微生物種類較多，但分離到的能耐14%（體積分數(shù)）酒精的菌株較少。

2.2 酵母菌的篩選

2.2.1 酵母菌的一級篩

將144株酵母菌采用無菌操作制備成菌懸液，用接種針分別接種于YPD固體培養(yǎng)基中，每個平板接15株～20株，于恒溫培養(yǎng)箱中40℃培養(yǎng)，待長出菌落后，倒入配好的TTC溶液，覆蓋菌落，40℃再繼續(xù)培養(yǎng)，注意及時觀察菌落的顏色變化，比較各菌株間的顏色深淺。TTC（2，3，5-氯化苯基四氮哇）是一種顯色劑，它對酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應，通過它可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母產(chǎn)酒精能力的高低[6]。顏色深的菌株呼吸酶活力強，有較強的產(chǎn)酒精能力，從每一平板中記下顏色較深的1株～2株菌，作為二級篩的出發(fā)菌株，共得到12株酵母菌。

2.2.2 酵母菌的二級篩

一級篩得到12株性狀較好的菌株，在培養(yǎng)基中添加不同含量的酒精，在40℃下進行二級篩實驗，重復3次，其產(chǎn)氣結果見表2。

2.2.3 酵母菌的三級篩

由三級篩結果可看出TJ-18號酵母的酒精產(chǎn)率比較高，達到5.9%（體積分數(shù)）；殘還原糖約為1.00%，糖利用率較高，且發(fā)酵力突出，72 h CO2失重為10.4 g。故后續(xù)研究將TJ-18菌為最終發(fā)酵用菌株。

2.3 酵母菌的初步鑒定

2.3.1 TJ-18菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征

TJ-18菌株在YPD液體培養(yǎng)基中（38℃）培養(yǎng)24 h細胞呈橢圓形或卵圓形，細胞大?。?.5～5.5）μm×（5.25～8.75）μm。繁殖方式為一端出芽。再生孢子培養(yǎng)基38℃培養(yǎng)9 d后有子囊孢子形成，每個子囊含1枚～2枚子囊孢子，無明顯顏色。在YPD瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落為乳白色、平滑、有光澤、邊緣整齊。在加蓋片的玉米淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)38℃培養(yǎng)8 d后形成假菌。

表2 二級篩實驗結果Table 2 Level two screening test results

表3 三級篩實驗結果Table 3 Level three screening test results

2.3.2 生理生化試驗

2.3.2.1 發(fā)酵糖類試驗

采用麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖及半乳糖做發(fā)酵糖試驗，其結果見表4。

表4 TJ-18發(fā)酵糖類實驗結果Table 4 TJ-18 fermentation of sugars in experimental results

2.3.2.2 同化碳源試驗

TJ-18同化碳源實驗結果見表5。

表5 TJ-18同化碳源實驗結果Table 5 TJ-18 carbon source assimilation experiments

2.3.2.3 同化氮源試驗

TJ-18同化氮源實驗結果見表6。

2.3.2.4 輔助生理生化試驗

TJ-18輔助生理生化實驗結果見表7。

根據(jù)生理生化試驗結果，并對照《TheYeasts：ataxonomicstudy》（第三版）對酵母的描述，TJ-18為酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。故將其命名為Saccharomyces cerevisiae TJ-18。

表6 TJ-18同化氮源試驗結果Table 6 TJ-18 assimilation of nitrogen source test results

表7 TJ-18輔助生理生化實驗結果Table 7 TJ-18 auxiliary results of physiological and biochemical

3 結論

本研究從自然界中分離得到的一株優(yōu)良的酒精生產(chǎn)菌株TJ-18，酒精產(chǎn)率比較高，達到5.9%（體積分數(shù)）；殘還原糖約為1.00%，糖利用率較高，且發(fā)酵力突出，40℃培養(yǎng)72 h，CO2失重為10.4 g，表現(xiàn)出很好的發(fā)酵產(chǎn)酒精能力。同時也對優(yōu)勢菌株的傳代穩(wěn)定性進行了考察，將得到的優(yōu)勢菌株分別接種到斜面培養(yǎng)基上傳代5次，均表現(xiàn)出較好的傳代穩(wěn)定性。

微生物菌種質(zhì)量的好壞對發(fā)酵工業(yè)有著及其重要的影響，這一研究的技術關鍵在于獲得高滲透壓且酒精發(fā)酵速率快、耐酒精和耐高溫的酵母菌種，這也是人們的研究熱點。TJ-18在實驗過程中表現(xiàn)出較好的耐高溫和耐酒精特性，但是對具體適合該菌株的培養(yǎng)條件其它特性還不是很清楚，在后續(xù)實驗有待進一步研究。

[1] 劉暢,王濤,石翠芳.耐高溫酵母菌的篩選及特性研究[J].釀酒,2007,34(2):52-53

[2] 劉海臣,張敏楠,阮時雷,等.多樣品耐高溫產(chǎn)乙醇酵母的篩選及生長特性研究[J].食品科技,2008,33(3)18-19

[3] 陳思耘.酵母生物化學[M].山東:山東科學技術出版社,1990:12

[4] KREGER N Y W.The yeasts:a taxonomic study[M].Third re-vised and enlarged edition.The Netherlands:Elsevier sciencepublishers B.V,1984

[5]中國科學院微生物研究所.常見與常用真菌[M].科學出版社,1978

[6] 王梅,張澎湃,帥桂蘭,等.TTC在黃酒酵母選育中的應用[J].釀酒,2001,28(5):62-64